2) иммунохимии
3) колориметрии
4) фотометрии (+)
Для оценки активности ферментов сыворотки в рутинной лабораторной практике применяют фотометрический метод. Его основа — измерение оптической плотности реакционной смеси и регистрации её изменения во времени. Скорость увеличения или уменьшения оптической плотности пропорциональна скорости ферментативной реакции, поэтому активность рассчитывают в международных единицах на литр (Ед/л, U/L). Количественная связь между концентрацией поглощающего вещества и оптической плотностью описывается законом Бугера—Ламберта—Бера.
Наиболее часто используют кинетические спектрофотометрические методики: определяют образование продукта реакции либо расход субстрата. Например, активность некоторых ферментов оценивают по изменению концентрации НАДН или НАД+ при длине волны 340 нм; для других применяются окрашенные продукты, регистрируемые в видимой области спектра. В автоматических анализаторах фотометрическое измерение позволяет стандартизировать температуру, время инкубации, объём реагентов и длину волны, что обеспечивает воспроизводимость результата.
Колориметрия является частным вариантом оптического анализа, при котором оценивают интенсивность окраски раствора, однако в современных лабораториях термин фотометрия шире и включает измерения в ультрафиолетовом и видимом диапазонах. Электрофорез предназначен преимущественно для разделения белков и изоферментов, а иммунохимические методы — для определения концентрации специфических белков или антигенов. Поэтому именно фотометрия является базовым инструментальным подходом к измерению функциональной активности ферментов в сыворотке.
| Метод | Основной принцип | Что оценивают | Применение при исследовании ферментов |
|---|---|---|---|
| Фотометрия | Измерение оптической плотности и её изменения во времени | Скорость ферментативной реакции | Основной рутинный метод определения активности ферментов сыворотки |
| Спектрофотометрия | Фотометрическое измерение при выбранной длине волны, включая УФ-диапазон | Поглощение субстрата или продукта реакции | Кинетическое определение активности, в том числе по НАДН/НАД+ |
| Колориметрия | Оценка интенсивности окраски образовавшегося продукта | Концентрация окрашенного соединения | Используется в отдельных конечных и кинетических ферментативных реакциях |
| Иммунохимия | Специфическое взаимодействие антитела с антигеном | Массовая концентрация белка или изоформы | Определение количества фермента, но не его каталитической активности |
| Электрофорез | Разделение молекул в электрическом поле по заряду и размеру | Фракции белков и изоферменты | Типирование изоформ и уточнение происхождения повышенной активности |
| Титриметрия | Определение количества вещества по объёму раствора известной концентрации | Количество реагирующего субстрата или продукта | Исторический или специализированный подход, редко применяемый в рутинной автоматизации |
Результат фотометрического определения активности зависит от температуры, pH, концентрации субстрата, наличия кофакторов и времени измерения. Поэтому лаборатория должна строго соблюдать методические условия и использовать рекомендованные калибраторы и контрольные материалы. Интерпретацию активности проводят с учётом референсных интервалов, пола, возраста и клинического контекста. Повышение или снижение активности отражает изменение скорости реакции и не всегда прямо соответствует количеству фермента в крови.