2) щелочной гидролиз (+)
3) настаивание с этанолом
4) прямую экстракцию хлороформом
Основным лабораторным маркером употребления каннабиса в моче является 11-нор-9-карбокси-Δ9-тетрагидроканнабинол (ТГК-COOH). Значительная часть этого метаболита экскретируется не в свободном виде, а в форме полярного глюкуронидного конъюгата, который плохо переходит из водной фазы в органический экстрагент. Поэтому анализ только свободной фракции может приводить к занижению концентрации и снижению чувствительности исследования.
Щелочной гидролиз расщепляет связь между ТГК-COOH и глюкуроновой кислотой, высвобождая свободный метаболит. После завершения гидролиза образец подкисляют: карбоксильная группа ТГК-COOH переходит преимущественно в неионизированное состояние, благодаря чему вещество эффективнее извлекается методом жидкостно-жидкостной или твердофазной экстракции. Исследования подтверждают, что обработка щёлочью обеспечивает деконъюгацию ТГК-COOH-глюкуронида и повышает извлечение суммарного аналита.
Прямая экстракция мочи хлороформом преимущественно извлекает неполярные свободные соединения, но не обеспечивает полноценного выделения гидрофильных глюкуронидов. Кислотный гидролиз менее предпочтителен из-за возможной нестабильности отдельных каннабиноидных метаболитов и вариабельной полноты деконъюгации. Настаивание с этанолом применяется при исследовании растительного материала, но не является методом подготовки мочи для количественного определения суммарного ТГК-COOH.
| Подход к пробоподготовке | Воздействие на конъюгаты | Влияние на извлечение | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Щелочной гидролиз | Эффективно расщепляет ТГК-COOH-глюкуронид | Повышает количество доступного для экстракции свободного метаболита | Позволяет определять суммарный ТГК-COOH |
| Кислотный гидролиз | Полнота деконъюгации может быть вариабельной | Возможны потери или изменение отдельных аналитов | Не считается оптимальным выбором для максимального извлечения |
| Ферментативный гидролиз | Расщепляет глюкурониды β-глюкуронидазой | Обеспечивает мягкую пробоподготовку, но зависит от фермента и условий реакции | Используется как лабораторная альтернатива щелочному гидролизу |
| Прямая экстракция органическим растворителем | Конъюгаты сохраняются | Извлекается главным образом свободная липофильная фракция | Возможен ложно заниженный результат |
| Твердофазная экстракция после гидролиза | Аналит предварительно освобождён от глюкуроновой кислоты | Обеспечивает очистку и концентрирование ТГК-COOH | Подходит для последующего ГХ-МС или ВЭЖХ-МС/МС |
| Прямое ВЭЖХ-МС/МС-определение конъюгатов | Гидролиз не проводится | Свободная и глюкуронированная формы измеряются раздельно | Требует валидированной методики и соответствующих стандартов |
Таким образом, щелочная обработка увеличивает не собственно растворяющую способность экстрагента, а долю метаболита, переведённого из конъюгированной формы в свободную. Для получения высокой аналитической эффективности гидролиз должен сопровождаться последующей коррекцией pH и валидированной процедурой экстракции. Количественное подтверждение обычно выполняют методами хромато-масс-спектрометрии с применением внутренних стандартов. Такой подход снижает риск ложноотрицательного результата и обеспечивает более точное определение суммарного содержания метаболитов каннабиса в моче.