2) в тканях искомых веществ при обработке специфическими антителами
3) и определения положения специфической последовательности РНК в ходе амплификации исследуемой последовательности после их гибридизации
4) групп-специфических аллельных вариантов генов
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) основана на связывании флуоресцентно меченого ДНК-зонда с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты в денатурированном препарате. После гибридизации несвязавшийся зонд удаляют, а участки свечения оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии. Метод позволяет не только обнаружить заданную последовательность ДНК, но и установить её хромосомную локализацию непосредственно в метафазных хромосомах или ядрах интерфазных клеток.
В метафазной FISH сигнал сопоставляют с определённой хромосомой и её участком, что используется для выявления микроделеций, амплификаций и хромосомных перестроек. Интерфазная FISH сохраняет возможность анализа некультивируемых клеток и позволяет подсчитывать число сигналов в ядрах; диагностически значимыми являются, например, увеличение числа сигналов, отсутствие сигнала, а также формирование слитного сигнала при транслокации или раздельных сигналов break-apart-зонда. Иммуногистохимия выявляет белки, ПЦР и секвенирование определяют нуклеотидные варианты, но эти методы не обеспечивают непосредственной визуализации положения целевой последовательности в ядре.
| Метод или вариант исследования | Основной объект | Что определяется | Ключевая диагностическая особенность |
|---|---|---|---|
| Метафазная FISH | Метафазные хромосомы | Локализация специфической последовательности ДНК | Позволяет соотнести сигнал с конкретной хромосомой и цитогенетическим участком |
| Интерфазная FISH | Интерфазные ядра | Число копий и наличие отдельных генетических перестроек | Не требует культивирования клеток; оценивается количество и распределение флуоресцентных сигналов |
| FISH с fusion-зондом | Два локуса, участвующие в перестройке | Слияние генов или хромосомных участков | Появление слитного сигнала указывает на транслокацию или другую реципрокную перестройку |
| FISH с break-apart-зондом | Один ген с двумя фланкирующими участками | Разрыв исследуемого локуса | Разделение ранее соседних сигналов свидетельствует о перестройке гена |
| Иммуногистохимия | Белковые антигены в ткани или клетке | Экспрессию и распределение белка | Основана на реакции антиген–антитело, а не на комплементарной гибридизации нуклеиновых кислот |
| ПЦР, количественная ПЦР и секвенирование | Выделенная ДНК или РНК | Наличие последовательности, её количество или нуклеотидный вариант | Высокая аналитическая чувствительность, но отсутствует визуализация хромосомной локализации in situ |
Принципиальным признаком FISH является пространственное сохранение генетического материала в клетке, благодаря чему результат связан не только с наличием мишени, но и с её расположением. Метод применяют при диагностике хромосомных аномалий, онкогенных амплификаций, делеций и транслокаций, включая быстрый анализ интерфазных ядер. Количественная интерпретация требует подсчёта сигналов в достаточном числе ядер и сопоставления с установленными порогами лаборатории. Для поиска точечных мутаций и групп-специфических аллельных вариантов предпочтительнее молекулярно-генетические методы, прежде всего ПЦР с аллель-специфичными праймерами или секвенирование.