2) цитохимического определения
3) проточной цитометрии (+)
4) световой микроскопии окрашенного мазка костного мозга
Гемопоэтические стволовые клетки выявляют преимущественно методом проточной цитометрии с использованием панелей моноклональных антител, меченных флуорохромами. Метод позволяет одновременно оценивать несколько антигенов на поверхности клетки и выделять редкую популяцию по иммунному фенотипу: обычно CD34+, CD90+, CD117+, CD38low/−, с отсутствием зрелых линейно-специфических маркеров. В практической лабораторной диагностике чаще количественно определяют CD34-положительные гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки, поскольку абсолютное разграничение истинной стволовой клетки и раннего предшественника требует дополнительных функциональных исследований.
Проточная цитометрия основана на прохождении клеточной суспензии по одной через лазерный луч. По рассеянию света оценивают размер и внутреннюю гранулярность клеток, а по интенсивности флуоресценции — экспрессию определённых антигенов; последующая комбинация параметров позволяет сформировать гейт исследуемой популяции и рассчитать её долю или абсолютное количество. Это особенно важно при контроле мобилизации клеток-предшественников в периферическую кровь и оценке клеточного продукта перед трансплантацией.
Световая микроскопия окрашенного мазка костного мозга позволяет оценить морфологию и общий миелоидно-эритроидный состав, но не обеспечивает надёжной идентификации малочисленных стволовых клеток. Цитохимические реакции характеризуют отдельные ферментные свойства и линии дифференцировки, а иммуноэлектрофорез предназначен главным образом для анализа белков и иммуноглобулинов, но не для клеточного иммунophenotyping.
| Подход | Основной объект оценки | Диагностическая ценность для гемопоэтических стволовых клеток |
|---|---|---|
| Многопараметрическая проточная цитометрия | Экспрессия поверхностных и внутриклеточных антигенов на отдельных клетках | Метод выбора для выявления и количественного определения CD34+-клеток с уточнением их иммунного фенотипа |
| CD34 | Маркер ранних гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток | Используется как основной клинический суррогатный маркер, но не является абсолютно специфичным |
| CD90 и CD117 | Дополнительные признаки раннего гемопоэтического фенотипа | Помогают уточнить принадлежность CD34+-клеток к незрелому компартменту |
| CD38 | Маркер степени созревания | Низкая или отсутствующая экспрессия чаще соответствует более примитивным стволовым клеткам |
| Линейные маркеры CD3, CD14, CD19, CD33, CD56 и другие | Принадлежность к лимфоидной или миелоидной линии | Отсутствие или слабая экспрессия помогает выделить lineage-negative ранние клетки |
| Световая микроскопия мазка | Размер, ядерно-цитоплазматическое соотношение, структура хроматина, морфология клеток | Ограниченная специфичность: стволовые клетки трудно отличить от незрелых бластных форм |
| Цитохимия и иммуноэлектрофорез | Ферментные реакции или растворимые белки | Не предназначены для точного подсчёта и иммунophenotypic идентификации гемопоэтических стволовых клеток |
Результат проточной цитометрии интерпретируют с учётом источника материала, жизнеспособности клеток и применённой стратегии гейтирования. Для достоверной оценки важны стандартизованные панели антител, контроль качества и исключение дебриса, агрегатов и неклеточных событий. Функциональную стволовость подтверждают способностью клеток к самоподдержанию и мультилинейному восстановлению кроветворения, однако такие исследования не относятся к рутинному скринингу. Поэтому именно проточная цитометрия является оптимальным лабораторным методом фенотипического обнаружения и количественной оценки данной клеточной популяции.