2) электрофорез
3) секвенирование
4) ДНК-чипы
Гибридизационно-флуоресцентный метод является основным способом детекции продуктов ПЦР в современной лабораторной практике, прежде всего в формате ПЦР в реальном времени (Real-time PCR, qPCR). В реакционную смесь вводят флуоресцентно меченый олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку амплифицируемой последовательности. При гибридизации зонда с ампликоном изменяется интенсивность флуоресценции, которая регистрируется прибором на каждом цикле амплификации; по достижению заданного порогового уровня рассчитывают значение Ct/Cq.
Интенсивность флуоресцентного сигнала связана с количеством образовавшегося специфического продукта, поэтому метод позволяет одновременно обнаруживать нуклеиновую кислоту и оценивать ее исходную концентрацию. Использование последовательностно-специфичных зондов повышает аналитическую специфичность, снижает риск регистрации неспецифических продуктов и дает возможность проводить мультиплексную диагностику с различными флуорофорами в одной пробирке. В зависимости от конструкции системы применяют гидролизуемые зонды, например TaqMan, либо зонды с флуоресцентным резонансным переносом энергии.
Электрофорез выявляет ампликоны после завершения реакции по размеру фрагментов и используется преимущественно для контроля постановки или анализа отдельных продуктов. Секвенирование определяет нуклеотидную последовательность и необходимо для подтверждения мутаций, идентификации возбудителей или генотипирования, но не является рутинным методом первичной детекции большинства ПЦР-продуктов. ДНК-чипы предназначены для параллельного анализа множества заранее заданных мишеней и применяются в специализированных исследованиях.
| Метод | Принцип регистрации | Основной результат | Типичное применение |
|---|---|---|---|
| Гибридизационно-флуоресцентный | Регистрация флуоресценции при связывании зонда с ампликоном в ходе циклов ПЦР | Качественное обнаружение и/или количественная оценка по Ct/Cq | Рутинная диагностика инфекций, определение мутаций, вирусной нагрузки, мультиплексные панели |
| Флуоресцентный интеркалирующий краситель | Связывание красителя с двухцепочечной ДНК независимо от ее последовательности | Накопление общей двухцепочечной ДНК; специфичность контролируют анализом кривой плавления | qPCR при наличии валидированных праймеров и необходимости снижения стоимости реакции |
| Электрофорез | Разделение фрагментов ДНК в электрическом поле по размеру | Наличие продукта и соответствие его размера ожидаемому | Контроль амплификации, анализ длины фрагмента, выявление неспецифических продуктов |
| Секвенирование | Определение последовательности нуклеотидов амплифицированного фрагмента | Нуклеотидная последовательность, вариант мутации или генотип | Подтверждение генетических вариантов, типирование и идентификация микроорганизмов |
| ДНК-чипы | Гибридизация образца с множеством иммобилизованных олигонуклеотидных зондов | Профиль присутствия большого числа заранее заданных мишеней | Параллельный анализ генов, экспрессионные и исследовательские панели |
Преимущество гибридизационно-флуоресцентной детекции заключается в закрытом формате реакции, что уменьшает риск контаминации ампликонами. Автоматическая регистрация сигнала сокращает время исследования и обеспечивает стандартизируемую интерпретацию результатов. Для надежной диагностики необходимы положительный и отрицательный контроли, контроль экстракции и оценка порогового цикла в соответствии с валидированной методикой.