2) обнаружения специфических фрагментов ДНК или РНК возбудителя в материале от обследуемого (+)
3) определения чувствительности к фагам
4) обнаружения продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в материале от обследуемого
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) предназначена для выявления специфического участка нуклеиновой кислоты возбудителя — ДНК или РНК — в клиническом материале. Метод основан на многократном ферментативном копировании выбранной последовательности с помощью праймеров, комплементарных геному микроорганизма. При исследовании РНК-содержащих возбудителей предварительно выполняют обратную транскрипцию с образованием комплементарной ДНК, после чего проводят амплификацию.
Специфичность ПЦР обеспечивается подбором праймеров и, в режиме real-time ПЦР, флуоресцентных зондов к видоспецифичным или генетически консервативным участкам. Результат регистрируется по наличию амплифицированного фрагмента; количественная ПЦР дополнительно позволяет оценить вирусную или микробную нагрузку, обычно по значению порогового цикла (Ct). Важно учитывать, что обнаружение нуклеиновой кислоты не всегда свидетельствует о жизнеспособности возбудителя, поскольку генетический материал может сохраняться после его гибели.
Серологические методы выявляют иммунный ответ организма, культуральные методы — рост жизнеспособного микроорганизма, а определение антигенов или метаболитов направлено на поиск продуктов или структурных компонентов возбудителя. Поэтому именно обнаружение специфических фрагментов ДНК или РНК в образце является диагностической целью постановки ПЦР. Достоверность исследования зависит от правильного взятия и транспортировки материала, наличия положительного и отрицательного контролей, а также отсутствия ингибиторов амплификации и контаминации.
| Метод | Что выявляет | Основной диагностический результат | Ключевая особенность |
|---|---|---|---|
| ПЦР | Специфический фрагмент ДНК возбудителя | Наличие или отсутствие целевой нуклеотидной последовательности | Высокая аналитическая чувствительность и специфичность; жизнеспособность возбудителя не оценивает |
| ОТ-ПЦР | РНК возбудителя после обратной транскрипции | Выявление РНК-генома или РНК-мишени | Применяется для РНК-содержащих вирусов и некоторых РНК-мишеней микроорганизмов |
| ПЦР в реальном времени | Амплифицируемый фрагмент с флуоресцентной регистрацией | Качественный результат и, при калибровке, количество копий нуклеиновой кислоты | Значение Ct обратно связано с исходным количеством генетического материала |
| Серологическое исследование | Специфические антитела или антигены в сыворотке | Иммунный ответ или наличие антигенного материала | Антитела могут появляться с диагностическим окном и сохраняться после элиминации возбудителя |
| Культуральный метод | Жизнеспособный микроорганизм | Рост колоний или культуры с последующей идентификацией | Позволяет определить чувствительность к антимикробным препаратам, но требует времени и подходящей питательной среды |
| Определение антигенов или метаболитов | Белки, токсины и другие продукты жизнедеятельности возбудителя | Наличие специфического структурного компонента или метаболита | Не является прямым выявлением нуклеиновой кислоты |
| Фаготипирование | Чувствительность бактерии к специфическим бактериофагам | Лизис культуры под действием фага | Используется для характеристики выделенного штамма, а не для постановки ПЦР |
Интерпретация положительного результата должна учитывать клинические проявления, локализацию инфекции и качество образца. Отрицательный результат не исключает заболевание при слишком раннем взятии материала, низкой концентрации возбудителя или наличии ингибиторов. При количественной ПЦР динамика вирусной или микробной нагрузки может использоваться для оценки течения инфекции и ответа на лечение. Лабораторное заключение формулируют с указанием выявленной мишени, типа материала и применённого варианта метода.