2) фотометрии
3) детекции флуоресценции (+)
4) денситометрии
В ПЦР в режиме реального времени накопление ампликона регистрируется непосредственно во время каждого цикла по увеличению интенсивности флуоресцентного сигнала. Флуорофор может входить в состав интеркалирующего красителя, связывающегося с двуцепочечной ДНК, либо быть частью специфического олигонуклеотидного зонда. По мере образования продуктов амплификации возрастает флуоресценция, которую фиксирует оптическая система прибора.
Количественная оценка основана на определении порогового цикла (Ct, или Cq) — номера цикла, на котором сигнал превышает установленный порог на фоне базовой линии. Чем больше исходное количество целевой нуклеиновой кислоты, тем раньше достигается пороговое значение и тем меньше Ct. Поэтому метод позволяет не только выявлять генетический материал, но и проводить относительное или абсолютное количественное определение при использовании калибровочных материалов.
Турбидиметрия оценивает изменение мутности, фотометрия — поглощение света, а денситометрия — оптическую плотность или распределение интенсивности изображения; эти принципы не являются основным способом регистрации сигнала в real-time ПЦР. Флуоресцентный мониторинг обеспечивает анализ кинетики реакции, возможность мультиплексного определения мишеней и контроль достоверности амплификации в закрытой пробирке.
| Этап или показатель | Что регистрируется | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Базовая линия | Фоновая флуоресценция до выраженного накопления ампликона | Используется для корректного расчёта порогового сигнала |
| Экспоненциальная фаза | Быстрое пропорциональное увеличение флуоресценции | Наиболее информативный участок для количественной оценки |
| Ct/Cq | Цикл пересечения кривой амплификации с порогом | Обратно связан с исходной концентрацией целевой нуклеиновой кислоты |
| Интеркалирующий краситель | Флуоресценция при связывании с двуцепочечной ДНК | Простой способ детекции, но возможна регистрация неспецифических продуктов |
| Специфический зонд | Флуоресценция после гибридизации с мишенью и разрушения или изменения зонда | Повышает аналитическую специфичность реакции |
| Мультиплексная реакция | Сигналы разных флуорофоров в отдельных спектральных каналах | Позволяет одновременно выявлять несколько мишеней или внутренний контроль |
| Отсутствие сигнала при сохранённом внутреннем контроле | Порог не достигнут для целевой мишени | Интерпретируется как отрицательный результат при условии адекватного контроля реакции |
Флуоресцентная регистрация выполняется в каждом цикле без вскрытия реакционной системы, что снижает риск контаминации ампликоном. Достоверность результата оценивают вместе с кривой амплификации, значением Ct и результатами положительного, отрицательного и внутреннего контролей. При диагностике РНК-содержащих возбудителей перед амплификацией выполняют обратную транскрипцию с образованием кДНК. Некорректная форма кривой или отсутствие сигнала внутреннего контроля требует повторной постановки либо исследования причины ингибирования реакции.