2) взаимодействие антиген-антитело
3) полимеризация молекул
4) копирование специфических участков молекулы нуклеиновых кислот (+)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на селективном многократном копировании определённого фрагмента ДНК. Специфичность реакции задаётся двумя праймерами — короткими олигонуклеотидами, комплементарными участкам по обе стороны целевой последовательности. Поэтому результатом процесса становится накопление ампликона — множества копий исходного специфического участка нуклеиновой кислоты. В случае РНК-матрицы перед амплификацией выполняют обратную транскрипцию с образованием комплементарной ДНК (кДНК).
Каждый цикл включает денатурацию двойной спирали, отжиг праймеров и ферментативное удлинение цепи термостабильной ДНК-полимеразой в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Повторение циклов приводит к экспоненциальному увеличению количества целевого продукта, что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность метода. Таким образом, полимеризация является отдельной стадией реакции, а её основным принципом служит именно копирование специфического участка молекулы нуклеиновой кислоты.
| Компонент или этап | Молекулярное событие | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Матрица | ДНК исследуемого образца или кДНК, полученная из РНК | Определяет, возможно ли выявление генетического материала возбудителя, мутации или экспрессируемой последовательности |
| Праймеры | Комплементарно связываются с границами целевого фрагмента | Обеспечивают аналитическую специфичность и задают длину ампликона |
| Денатурация | Разделение двухцепочечной ДНК на отдельные цепи при высокой температуре | Подготавливает матрицу для последующего присоединения праймеров |
| Отжиг праймеров | Связывание праймеров с комплементарными участками матрицы | Неправильная температура может привести к неспецифическим продуктам или снижению выхода ампликона |
| Элонгация | Термостабильная ДНК-полимераза достраивает новую цепь по принципу комплементарности | Формирует копию целевой последовательности; точность зависит от свойств используемого фермента |
| Многократное повторение циклов | Количество амплифицированных копий увеличивается преимущественно экспоненциально | Позволяет обнаруживать малые количества нуклеиновой кислоты при соблюдении требований к контролю загрязнения |
| Регистрация результата | Оценка конечного продукта или флуоресцентного сигнала в реальном времени | Определяет наличие мишени, а при количественной ПЦР — её исходную концентрацию по значению Ct/Cq |
ПЦР широко применяется для выявления инфекционных агентов, генетических вариантов и опухолевых молекулярных маркеров. В режиме реального времени накопление продукта регистрируется во время реакции, что позволяет проводить количественную оценку и снижает риск постамплификационного загрязнения. Интерпретация результата требует учёта положительного, отрицательного и внутреннего контрольных образцов, а также качества взятия и хранения материала. Положительный сигнал свидетельствует об обнаружении целевой последовательности, но клиническое значение результата оценивают совместно с симптомами и другими лабораторными данными.