2) учет результатов продуктов амплификации нуклеиновых кислот электрофоретическим и (или) гибридизационно-ферментным методом (+)
3) автоклавирование
4) амплификацию нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода
Рабочая зона 4, подзона 1 , предназначена для постамплификационного этапа ПЦР — обработки ампликонов и регистрации результата реакции. При электрофоретическом методе продукты амплификации разделяют в геле по размеру, после чего выявляют соответствующие полосы; диагностически значимым признаком обычно является наличие фрагмента ожидаемой длины в исследуемой пробе при корректных результатах положительного и отрицательного контролей. При гибридизационно-ферментном методе ампликон связывается с комплементарным меченым зондом, а ферментативная реакция формирует регистрируемый цветовой или иной сигнал.
Эти методики относятся к конечной детекции и, как правило, требуют переноса или вскрытия проб после амплификации. Поэтому работа с ампликонами выделяется в отдельную подзону, что снижает риск аэрозольного распространения продуктов ПЦР и контаминации исходных образцов. Амплификация с регистрацией флуоресцентного сигнала в режиме реального времени проводится в закрытой пробирке, а секвенирование и анализ на ДНК-чипах относятся к иным технологиям постамплификационной идентификации и не определяют назначение данной подзоны.
| Метод | Что регистрируется | Основной диагностический признак | Особенности организации работы |
|---|---|---|---|
| Электрофорез | Разделение фрагментов ДНК в геле по размеру | Полоса ампликона ожидаемой длины при валидных контролях | Обычно требует вскрытия пробирки и работы с продуктами амплификации |
| Гибридизационно-ферментная детекция | Связывание ампликона с комплементарным зондом и ферментативное окрашивание | Интенсивность сигнала выше установленного порога или наличие специфической реакции | Постамплификационная процедура с повышенным риском контаминации ампликонами |
| Гибридизационно-флуоресцентный метод | Флуоресцентный сигнал от зонда во время амплификации | Пересечение кривой флуоресценции порогового уровня, значение Ct/Cq | Регистрация обычно выполняется в закрытой реакционной системе |
| Секвенирование | Порядок нуклеотидов в амплифицированном фрагменте | Совпадение последовательности с целевым участком или выявление варианта | Самостоятельный этап расширенной идентификации, а не типичная детекция в данной подзоне |
| ДНК-чипы | Профиль гибридизации с множеством фиксированных зондов | Специфический набор положительных сигналов на участках чипа | Специализированная технология параллельного анализа |
| Автоклавирование | Термическое обеззараживание отходов и материалов | Соблюдение валидированных параметров стерилизации | Санитарно-противоэпидемическая процедура, не являющаяся учетом результатов ПЦР |
Таким образом, правильный ответ связан с детекцией амплифицированной нуклеиновой кислоты после завершения реакции. Ключевым организационным принципом ПЦР-лаборатории является разделение преамплификационных и постамплификационных потоков. Наиболее существенная причина такого разделения — предотвращение ложноположительных результатов вследствие переноса ампликонов. Результат учитывают только при наличии установленной специфичности метода и приемлемых значений внутрилабораторного контроля качества.