2) учет результатов продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования и (или) на ДНК-чипах (+)
3) автоклавирование
4) амплификация нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода
Рабочая зона 4-2 относится к постамплификационному этапу молекулярно-генетического исследования. В ней выполняют детекцию и углублённый анализ ранее полученных ампликонов посредством секвенирования, то есть определения последовательности нуклеотидов, и с применением ДНК-чипов, основанных на гибридизации исследуемых нуклеиновых кислот с иммобилизованными специфическими зондами. Такое назначение зоны соответствует принятой схеме функционального разделения ПЦР-лаборатории.
Выделение отдельной подзоны обусловлено высокой концентрацией продуктов амплификации, которые могут распространяться с аэрозолями и контаминировать реактивы, оборудование или клинические образцы. Попадание даже небольшого количества ампликонов в преамплификационные помещения способно привести к ложноположительным результатам. Поэтому зоны 4-1 и 4-2 изолируют от участков приёма материала, выделения нуклеиновых кислот и постановки реакции, а технологическое движение персонала и материалов организуют преимущественно в одном направлении — от чистых операций к постамплификационным.
Другие перечисленные процессы относятся к иным функциональным участкам: электрофоретическую и гибридизационно-ферментную детекцию проводят в зоне 4-1, а амплификацию с гибридизационно-флуоресцентной регистрацией в режиме реального времени — в зоне 3. Автоклавирование является способом обеззараживания отходов и лабораторных материалов и не определяет назначение подзоны 4-2.
| Рабочий участок | Основная операция | Ключевая характеристика |
|---|---|---|
| Зона 1 | Приём, регистрация и первичная обработка материала | Работа с исходными клиническими образцами до выделения нуклеиновых кислот |
| Зона 2 | Выделение ДНК или РНК | Получение очищенной нуклеиновой кислоты с минимизацией ингибиторов ПЦР |
| Зона 3 | Амплификация и флуоресцентная детекция | Проведение ПЦР в реальном времени без последующего вскрытия реакционных пробирок |
| Зона 4-1 | Электрофорез и гибридизационно-ферментная детекция | Постамплификационный анализ с открыванием пробирок; возможно очищение ампликонов перед секвенированием |
| Зона 4-2 | Секвенирование и анализ на ДНК-чипах | Определение нуклеотидной последовательности или гибридизационного профиля ампликонов |
| Участок обеззараживания | Автоклавирование отходов и использованных материалов | Обеспечивает биологическую безопасность, но не является методом детекции продуктов ПЦР |
Секвенирование применяют для идентификации микроорганизмов, обнаружения мутаций и уточнения генетических вариантов, тогда как ДНК-чипы позволяют одновременно исследовать множество заданных последовательностей. Оба подхода предполагают работу с продуктами уже завершённой амплификации и требуют строгого контроля постамплификационной контаминации. Раздельное размещение методов детекции также уменьшает риск перекрёстного переноса ампликонов между исследованиями. Следовательно, функциональным признаком зоны 4-2 является именно анализ амплифицированных нуклеиновых кислот методами секвенирования или ДНК-микрочипирования.