2) проточной цитофлюорометрии
3) молекулярно-генетического типирования (+)
4) комплементзависимого лимфоцитотоксического теста
HLA-генотип определяют методами молекулярно-генетического типирования, поскольку они исследуют нуклеотидную последовательность генов главного комплекса гистосовместимости. ДНК выделяют из лейкоцитов периферической крови, после чего анализируют полиморфные участки локусов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1 и других. Для этого применяют ПЦР с аллель-специфическими праймерами или зондами, секвенирование по Сэнгеру и высокопроизводительное секвенирование, позволяющее устанавливать HLA-аллели с высокой разрешающей способностью.
Иммунологические методы выявляют преимущественно экспрессированные антигены или антитела, но не определяют непосредственно структуру соответствующих генов. Проточная цитофлюориметрия характеризует мембранную экспрессию HLA-молекул с помощью флуоресцентно меченных антител, а комплементзависимый лимфоцитотоксический тест относится к серологическому фенотипированию и основан на повреждении лимфоцитов при связывании специфических антител. Иммуноферментный анализ чаще используется для обнаружения анти-HLA-антител и оценки гуморальной сенсибилизации, поэтому эти методы не обеспечивают точного аллельного генотипирования.
| Метод | Исследуемая мишень | Основной результат | Значение для HLA-типирования |
|---|---|---|---|
| ПЦР-SSP | Геномная ДНК | Наличие определённых аллелей или групп аллелей | Быстрое молекулярное типирование с низким или средним разрешением |
| ПЦР-SSO | Амплифицированные участки HLA-генов | Гибридизационный профиль аллелей | Типирование нескольких локусов со средним разрешением |
| Секвенирование по Сэнгеру | Нуклеотидная последовательность HLA-генов | Аллельный состав исследуемых локусов | Высокоразрешающее генотипирование, возможны фазовые неоднозначности |
| Высокопроизводительное секвенирование | Расширенные или полные последовательности HLA-генов | Точное определение аллелей и гаплотипов | Наиболее высокая разрешающая способность, особенно важна при трансплантации |
| Проточная цитофлюориметрия | HLA-антигены на поверхности клеток | Уровень и профиль экспрессии молекул | Фенотипическая оценка, не заменяет исследование генотипа |
| Комплементзависимый лимфоцитотоксический тест | Поверхностные HLA-антигены лимфоцитов | Серологический HLA-фенотип | Исторический метод с ограниченной разрешающей способностью |
| Иммуноферментный анализ | Анти-HLA-антитела или растворимые антигены | Наличие и концентрация иммунологических маркеров | Применяется для оценки сенсибилизации, а не для генотипирования |
Точное HLA-типирование имеет ключевое значение при подборе донора гемопоэтических стволовых клеток и оценке иммунологической совместимости при трансплантации органов. Чем выше разрешающая способность метода, тем точнее устанавливаются конкретные аллели и тем ниже риск нераспознанного HLA-несоответствия. Молекулярные технологии также применяются для выявления генетической предрасположенности к отдельным заболеваниям и фармакогенетически значимым нежелательным реакциям. Результат интерпретируют с учётом исследованных локусов, уровня разрешения и клинической задачи.