2) мутацию в гетерозиготном состоянии
3) экспансию триплетов (+)
4) мутацию в гомозиготном состоянии
Аллель-специфическая ПЦР в реальном времени предназначена преимущественно для выявления заранее известной нуклеотидной замены или небольшой мутации. Метод основан на избирательной гибридизации праймера либо флуоресцентного зонда с нормальной и мутантной последовательностями ДНК. Поэтому он позволяет обнаруживать варианты как в кодирующих, так и в интронных участках, если известны их точная локализация и нуклеотидный состав.
Экспансия триплетных повторов представляет собой увеличение числа повторяющихся трехнуклеотидных последовательностей, иногда до сотен или тысяч копий. Стандартная аллель-специфическая ПЦР не определяет точное количество повторов и может вообще не амплифицировать патологически удлиненный, часто GC-богатый участок. В результате возможен выпадающий аллель , когда выявляется только короткий нормальный фрагмент, что создает риск ошибочной интерпретации генотипа.
| Генетическое изменение | Возможность выявления | Предпочтительный подход |
|---|---|---|
| Известная точечная мутация | Надежно выявляется при наличии специфических праймеров или зондов | Аллель-специфическая ПЦР в реальном времени |
| Интронный вариант | Определяется, если исследуемая последовательность и положение варианта известны | Аллель-специфическая ПЦР или секвенирование |
| Гетерозиготная мутация | Регистрируются сигналы нормального и мутантного аллелей | Двухаллельная система флуоресцентной детекции |
| Гомозиготная мутация | Определяется сигнал мутантного аллеля при отсутствии сигнала аллеля дикого типа | Аллель-специфическая ПЦР с внутренним контролем |
| Небольшая делеция или инсерция | Может выявляться при заранее известной структуре изменения | Специфическая ПЦР, фрагментный анализ или секвенирование |
| Экспансия триплетных повторов | Стандартным аллель-специфическим методом надежно не определяется | Repeat-primed ПЦР, фрагментный анализ, Southern blot или длинночтение |
Для диагностики болезней экспансии повторов необходимо не только установить наличие измененного аллеля, но и оценить длину повторяющегося участка. Repeat-primed ПЦР подтверждает присутствие экспансии по характерному профилю амплификационных фрагментов, однако не всегда позволяет точно определить ее размер. При крупных экспансиях применяют Southern blot или методы длинночитающего секвенирования. Выбор методики зависит от предполагаемого диапазона повторов и особенностей конкретного гена.