2) гидролиз ДНК
3) присоединение поли-А-последовательности к 3′-концу эукариотической РНК
4) перенос денатурированной ДНК на нитроцеллюлозный фильтр для последующей гибридизации (+)
Блоттинг ДНК по Саузерну — метод молекулярной генетики, основанный на выделении фрагментов ДНК после расщепления рестриктазами, их разделении электрофорезом в агарозном геле, денатурации и переносе на мембрану. Исторически использовали нитроцеллюлозные фильтры, в современной практике чаще применяют нейлоновые мембраны. Зафиксированные одноцепочечные фрагменты затем подвергают гибридизации с меченым комплементарным ДНК- или РНК-зондом.
Отмеченный вариант верен, поскольку ключевым этапом метода является перенос денатурированной ДНК на твердую мембрану с последующей специфической гибридизацией. Зонд связывается только с участком нуклеотидной последовательности, обладающим комплементарностью, а выявление метки позволяет определить размер и наличие соответствующего рестрикционного фрагмента. Таким образом, метод может использоваться для анализа крупных геномных перестроек, делеций, некоторых дупликаций, полиморфизма длины рестрикционных фрагментов и подтверждения отдельных результатов молекулярно-генетических исследований.
Ультрацентрифугирование относится к физическим методам разделения частиц, гидролиз не является сущностью данного протокола, а присоединение полиаденилатного фрагмента характеризует процессинг эукариотической РНК, но не анализ ДНК. В отличие от амплификационных методов, блоттинг по Саузерну исследует исходные фрагменты геномной ДНК без обязательного их предварительного копирования. Ограничениями являются значительная длительность, необходимость относительно большого количества ДНК и трудоемкость по сравнению с ПЦР и секвенированием нового поколения.
| Метод | Исследуемый объект | Основной принцип | Типичный диагностический результат |
|---|---|---|---|
| Southern blot | Фрагменты ДНК | Рестрикция, электрофорез, денатурация, перенос на мембрану и гибридизация с зондом | Размер и наличие специфического геномного фрагмента, выявление RFLP и крупных перестроек |
| Northern blot | РНК | Разделение РНК и гибридизация с комплементарным зондом | Размер и относительное количество транскрипта, оценка экспрессии гена |
| Western blot | Белки | Электрофорез белков с последующим переносом и иммунным выявлением антителами | Наличие белка и его молекулярная масса, оценка специфического иммунного ответа |
| Dot blot или slot blot | ДНК, РНК или белки | Нанесение образца непосредственно на мембрану без электрофоретического разделения | Качественное или полуколичественное выявление мишени, но не определение размера фрагмента |
| ПЦР | Определенный участок ДНК или кДНК | Экспоненциальная амплификация целевой последовательности праймерами | Обнаружение мутации, патогена или специфического аллеля; количественная оценка при real-time ПЦР |
| FISH | Хромосомная ДНК в клетке | Гибридизация флуоресцентного зонда с мишенью непосредственно на хромосомном препарате | Локализация гена, выявление анеуплоидий, микроделеций и транслокаций |
| Секвенирование нового поколения | Множество фрагментов ДНК или РНК | Массивное параллельное считывание нуклеотидных последовательностей | Выявление точковых вариантов, небольших инделов и структурных изменений в широком объеме |
Специфичность Southern blot определяется последовательностью зонда и условиями гибридизации, включая температуру и концентрацию солей. Сигнал оценивают после удаления неспецифически связавшегося зонда, используя радиоактивную, ферментную или флуоресцентную метку. Метод особенно информативен, когда необходимо одновременно оценить размер геномного фрагмента и его структурную организацию.