2) лигирования
3) рестрикции
4) полимеразной цепной реакции (ПЦР) (+)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) предназначена для многократного копирования определённого участка ДНК in vitro. Амплификация происходит экспоненциально: в каждом цикле двухцепочечная ДНК денатурирует, праймеры присоединяются к комплементарным последовательностям, а термостабильная ДНК-полимераза синтезирует новые цепи из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. После нескольких десятков циклов образуется большое количество ампликона — фрагмента ДНК, расположенного между праймерами.
Специфичность ПЦР определяется последовательностью праймеров, поэтому метод позволяет избирательно увеличивать как диагностически значимый ген, так и участок, содержащий предполагаемую мутацию или инфекционный агент. Полученный продукт может быть выявлен электрофорезом, секвенирован, использован для дальнейшего клонирования или количественно оценён в режиме реального времени. При количественной ПЦР и цифровой ПЦР дополнительно определяют исходное количество целевой нуклеиновой кислоты.
Лигирование соединяет фрагменты ДНК фосфодиэфирными связями и не приводит к их массовому копированию. Рестрикция, напротив, расщепляет ДНК в специфических сайтах, а иммуноферментный анализ выявляет антигены или антитела по ферментативной метке и не используется для амплификации ДНК. Поэтому именно ПЦР является методом получения большого количества заданного фрагмента ДНК из минимального исходного материала.
| Метод | Основная мишень | Механизм | Результат |
|---|---|---|---|
| ПЦР | Определённый участок ДНК между праймерами | Циклическая денатурация, отжиг праймеров и синтез цепей ДНК термостабильной полимеразой | Экспоненциальное накопление специфического ампликона |
| Количественная ПЦР | Целевая последовательность ДНК или предварительно полученная кДНК | Регистрация флуоресцентного сигнала во время амплификации | Определение относительного или абсолютного количества исходной нуклеиновой кислоты |
| Цифровая ПЦР | Целевая последовательность в отдельных микрореакциях | Разделение образца на множество независимых реакционных объёмов и подсчёт положительных реакций | Высокоточная абсолютная количественная оценка, в том числе редких вариантов |
| Рестрикция | Специфические сайты рестрикционных эндонуклеаз | Ферментативное расщепление ДНК в определённых последовательностях | Набор фрагментов различной длины; амплификации не происходит |
| Лигирование | Концы фрагментов ДНК | Соединение фрагментов ДНК ДНК-лигазой | Получение рекомбинантной или кольцевой молекулы без многократного копирования мишени |
| ИФА | Антиген или антитело | Иммунологическое связывание с ферментативной регистрацией сигнала | Выявление или количественная оценка белковых маркеров, а не получение фрагмента ДНК |
Ключевым условием успешной ПЦР является наличие праймеров, комплементарных границам нужного участка. Ошибки подбора праймеров, ингибиторы реакции или контаминация могут приводить соответственно к ложноотрицательным или ложноположительным результатам. Для подтверждения специфичности ампликона применяют электрофоретический анализ, плавильный анализ, рестрикционный контроль или секвенирование.