2) аллель-специфическую ПЦР
3) высокопроцессивное секвенирование (+)
4) гибридизацию in situ
МикроРНК — это короткие некодирующие РНК длиной примерно 18–24 нуклеотида, регулирующие экспрессию генов преимущественно на посттранскрипционном уровне через комплекс RISC. Для изучения их профиля экспрессии применяют высокопроизводительное секвенирование малых РНК (small RNA-seq): после выделения РНК и подготовки библиотеки миллионы молекул секвенируют параллельно, а полученные последовательности идентифицируют и количественно оценивают. Метод позволяет одновременно анализировать большое число микроРНК, выявлять различия их уровня между образцами, обнаруживать новые микроРНК и варианты зрелых молекул — изомиры.
Принципиальное преимущество секвенирования состоит в прямом подсчёте последовательностей микроРНК с последующей нормализацией данных и статистической оценкой дифференциальной экспрессии. MLPA предназначен главным образом для выявления делеций, дупликаций и изменений числа копий ДНК; аллель-специфическая ПЦР выявляет конкретный вариант нуклеотидной последовательности. Гибридизация in situ может показать пространственную локализацию определённой микроРНК в клетках или тканях, но обычно не обеспечивает широкого количественного профилирования всего набора микроРНК.
| Метод | Основной объект исследования | Диагностические возможности | Ограничения при анализе микроРНК |
|---|---|---|---|
| Высокопроизводительное секвенирование малых РНК | Последовательности и относительное количество микроРНК | Комплексное профилирование, сравнительный анализ экспрессии, поиск новых микроРНК и изомиров | Требует качественной подготовки библиотеки, биоинформатической обработки и нормализации данных |
| MLPA-анализ | Участки геномной ДНК | Выявление делеций, дупликаций и изменений числа копий генов или экзонов | Не измеряет уровень экспрессии зрелых микроРНК |
| Аллель-специфическая ПЦР | Конкретный нуклеотидный вариант ДНК | Таргетное обнаружение известной мутации или полиморфизма | Не предназначена для одновременного анализа множества микроРНК и их экспрессии |
| Гибридизация in situ | Мишень в морфологически сохранённой клетке или ткани | Определение тканевой и внутриклеточной локализации конкретной микроРНК | Ограниченная мультиплексность и менее удобная количественная оценка общего профиля экспрессии |
| ОТ-ПЦР в реальном времени | Заранее выбранная микроРНК после обратной транскрипции | Чувственное подтверждение уровня отдельных микроРНК в целевых образцах | Обычно анализирует ограниченное число заранее известных мишеней |
| Микрочипы экспрессии | Набор заранее известных последовательностей микроРНК | Параллельное сравнительное исследование экспрессии известных микроРНК | Не выявляют новые последовательности и зависят от состава зондов на чипе |
При интерпретации результатов small RNA-seq учитывают качество исходной РНК, клеточный состав образца и возможную деградацию материала. Для корректного сравнения используют биологические повторы, внутренние или внешние стандарты и валидируют ключевые находки методом количественной ОТ-ПЦР. Особое внимание уделяют различению истинной микроРНК, изомира и фрагментов других малых РНК, поскольку они могут иметь сходную длину. Таким образом, высокопроизводительное секвенирование является методом выбора для широкого и discovery-ориентированного исследования экспрессии микроРНК.