2) секвенирование по Сэнгеру (+)
3) блот-гибридизацию
4) MLPA
Секвенирование по Сэнгеру является классическим ортогональным методом подтверждения вариантов, обнаруженных при NGS. Его принцип основан на включении в растущую цепь ДНК дидезоксинуклеотидов, прекращающих элонгацию; последующее разделение фрагментов методом капиллярного электрофореза формирует электрофореграмму нуклеотидной последовательности. При гетерозиготной замене в соответствующей позиции выявляются два перекрывающихся пика, а при небольшой делеции или вставке — характерное смещение хроматограмм после места варианта.
Подтверждение методом Сэнгера повышает аналитическую достоверность результата NGS за счёт применения независимого метода с иным принципом детекции. Оно особенно информативно для единичных нуклеотидных вариантов и небольших инделов, расположенных в участке с достаточным качеством покрытия и пригодном для амплификации. При интерпретации учитывают качество электрофореграммы, направленность чтения, соответствие варианта референсной последовательности и, при необходимости, подтверждение на втором направлении.
Другие перечисленные методы решают иные диагностические задачи. ПЦР-ПДРФ применима только тогда, когда конкретная замена создаёт или устраняет сайт рестрикции; блот-гибридизация главным образом используется для анализа крупных перестроек, повторов или оценки размера фрагментов. MLPA предназначена преимущественно для выявления делеций и дупликаций экзонов или участков генома и не подтверждает большинство точечных вариантов, выявленных при NGS.
| Метод | Основная мишень | Диагностическая роль | Ключевые ограничения |
|---|---|---|---|
| Секвенирование по Сэнгеру | SNV и небольшие инделы | Ортогональное подтверждение варианта NGS и уточнение его последовательности | Низкая пропускная способность; ограниченная чувствительность к низкоуровневому мозаицизму |
| ПЦР-ПДРФ | Варианты, изменяющие сайт рестрикции | Быстрый таргетный анализ заранее известной мутации | Неприменима, если мутация не влияет на сайт рестрикции; возможны неполное расщепление и неспецифическая амплификация |
| Блот-гибридизация | Крупные фрагменты ДНК, повторы, перестройки | Оценка размера фрагмента и выявление отдельных крупных изменений генома | Трудоёмкость, длительность и меньшая аналитическая производительность по сравнению с современными методами |
| MLPA | Изменение числа копий экзонов или генов | Выявление делеций и дупликаций, включая экзонный уровень | Не предназначена для надёжного обнаружения большинства SNV и малых инделов |
| NGS | Множество генов и вариантов разных типов | Первичный высокопроизводительный поиск наследственных или соматических вариантов | Требует контроля покрытия, качества чтений, артефактов и независимой верификации клинически значимых находок |
| Критерий качественного подтверждения | Совпадение результата в независимом анализе | Подтверждение нуклеотидной замены или индела в том же геномном координатном участке | Результат оценивают с учётом аллельной доли, качества сигнала, глубины покрытия и возможного мозаицизма |
Секвенирование по Сэнгеру не заменяет NGS при необходимости анализа большого числа генов, а дополняет его на этапе верификации отдельных находок. При низкой аллельной доле, подозрении на мозаицизм или наличии сложного геномного контекста могут потребоваться высокочувствительные таргетные методы или цифровая ПЦР. Выбор подтверждающего исследования должен соответствовать типу варианта и требованиям валидированной лабораторной методики. Клиническая значимость результата определяется не только фактом подтверждения, но и совместной интерпретацией популяционных, функциональных и клинико-генеалогических данных.