2) асимметричной ПЦР
3) мультиплексной ПЦР
4) ПЦР в реальном времени (+)
Правильный ответ — ПЦР в реальном времени (qPCR, real-time PCR). При этом методе накопление ампликона регистрируется непосредственно во время каждого цикла по изменению флуоресценции. Для детекции применяют интеркалирующие красители, например SYBR Green, либо флуоресцентно меченые специфические зонды, такие как системы TaqMan.
Количественная оценка основана на определении цикла, на котором сигнал пересекает заданный порог, — значения Ct или Cq. Чем больше исходное количество целевой ДНК, тем раньше достигается порог флуоресценции. Абсолютную концентрацию рассчитывают по калибровочной кривой, построенной для стандартов с известным числом копий, а относительное содержание — сравнением Cq исследуемого и референсного образцов с учетом эффективности амплификации.
Флуоресценция в данном случае является не просто способом визуализации конечного продукта, а инструментом мониторинга кинетики реакции. Обратная транскрипция характеризует получение кДНК из РНК, асимметричная ПЦР — преимущественное образование одной цепи, а мультиплексная ПЦР — одновременную амплификацию нескольких мишеней; ни один из этих признаков сам по себе не определяет количественный формат анализа.
| Метод | Основное назначение | Принцип регистрации | Результат |
|---|---|---|---|
| ПЦР в реальном времени | Количественное определение ДНК или кДНК | Регистрация флуоресценции в каждом цикле амплификации | Значение Cq/Ct, абсолютная или относительная концентрация |
| Классическая конечная ПЦР | Обнаружение присутствия целевой последовательности | Анализ продукта после завершения реакции, обычно электрофорезом | Преимущественно качественный результат; точная количественная оценка ограничена |
| ПЦР с обратной транскрипцией | Исследование РНК-мишеней через промежуточное получение кДНК | Синтез кДНК обратной транскриптазой с последующей амплификацией | Выявление или количественная оценка РНК только при сочетании с real-time ПЦР |
| Асимметричная ПЦР | Получение преимущественно одноцепочечного ампликона | Неравные концентрации праймеров | Одноцепочечный продукт для гибридизации, секвенирования или иммуноанализа |
| Мультиплексная ПЦР | Одновременное исследование нескольких мишеней | Несколько пар праймеров в одной реакционной смеси | Параллельное выявление нескольких фрагментов; количественность не является обязательным свойством |
| Цифровая ПЦР | Высокоточное абсолютное количественное определение | Разделение образца на множество микрореакций и подсчет положительных partition | Число копий без обязательной стандартной кривой, с расчетом по распределению Пуассона |
Для достоверной количественной интерпретации контролируют эффективность амплификации, специфичность реакции и наличие отрицательных и положительных контролей. При использовании SYBR Green необходимо дополнительно подтверждать специфичность продукта, например анализом кривой плавления. При применении зондов специфичность выше, поскольку флуоресцентный сигнал возникает только при связывании с комплементарной целевой последовательностью.