2) ДНК-полимеразу
3) ДНК-матрицу
4) ионы магния
Рестриктаза не относится к обязательным компонентам стандартной реакционной смеси для полимеразной цепной реакции. Это рестрикционная эндонуклеаза — фермент, распознающий определённые нуклеотидные последовательности и расщепляющий ДНК по фосфодиэфирным связям. В ПЦР её функция не требуется, поскольку амплификация основана на многократном циклическом прохождении денатурации матрицы, отжига праймеров и элонгации синтезируемой цепи.
ДНК-матрица содержит участок, который необходимо амплифицировать, термостабильная ДНК-полимераза осуществляет синтез комплементарной цепи, а ионы магния являются кофактором фермента и участвуют в связывании дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с активным центром полимеразы. В стандартную смесь также входят праймеры, дНТФ, буфер и вода. Рестриктазы могут применяться после ПЦР при анализе полиморфизма длины рестрикционных фрагментов или в отдельных специализированных протоколах, но не являются базовым компонентом самой реакции амплификации.
| Компонент | Основная функция | Роль в стандартной ПЦР |
|---|---|---|
| ДНК-матрица | Содержит амплифицируемую последовательность | Обязательный компонент |
| Праймеры | Определяют границы ампликона и предоставляют 3′-гидроксильную группу для начала синтеза | Обязательные компоненты |
| Термостабильная ДНК-полимераза | Катализирует присоединение нуклеотидов к растущей цепи ДНК | Обязательный ферментный компонент |
| дНТФ | Служат строительным материалом для синтеза новых цепей ДНК | Обязательные субстраты реакции |
| Ионы Mg2+ | Кофактор ДНК-полимеразы; влияют на эффективность и специфичность амплификации | Обязательный компонент в оптимальной концентрации |
| Буферный раствор | Поддерживает необходимый pH и ионную силу реакционной среды | Обязательный компонент |
| Рестриктаза | Специфически расщепляет ДНК в участках узнавания | Не входит в стандартную смесь; используется преимущественно для последующего анализа |
После амплификации продукт ПЦР может быть исследован электрофорезом, секвенированием или обработан рестриктазой в рамках метода RFLP. Добавление рестриктазы непосредственно в ПЦР не заменяет праймеры, полимеразу или кофакторы и не обеспечивает синтез новых копий ДНК. Избыток ионов магния, напротив, способен снижать специфичность реакции за счёт неспецифического спаривания праймеров, поэтому их концентрацию оптимизируют экспериментально. Достоверность результата оценивают с использованием положительного и отрицательного контролей, включая контроль без матрицы.