2) клетками, готовыми к трансформации
3) подходящими
4) компетентными (+)
Компетентными называют клетки, способные захватывать чужеродную ДНК из окружающей среды и использовать её генетическую информацию. При работе с плазмидами это означает, что клеточная оболочка и мембрана становятся проницаемыми для кольцевой молекулы ДНК, после чего плазмида попадает в цитоплазму и может сохраняться в клетке в автономном состоянии или интегрироваться в геном.
Компетентность бывает естественной и искусственно индуцированной. Естественная компетентность формируется у некоторых бактерий в определённых фазах роста и регулируется специализированными белками транспорта ДНК. В лабораторной практике чаще используют химически компетентные клетки, обработанные растворами хлорида кальция или рубидия, либо электрокомпетентные клетки, в которые плазмида вводится коротким электрическим импульсом, временно создающим поры в мембране.
Факт успешной трансформации подтверждают селекцией: плазмида обычно содержит ген устойчивости к антибиотику или другой селективный маркер. Однако сама компетентность ещё не гарантирует получение стабильного трансформанта: необходимы совместимость точки начала репликации плазмиды с клеткой-хозяином, экспрессия маркера и сохранение плазмиды при делении.
| Вид компетентности или этап | Основной механизм | Практическое значение |
|---|---|---|
| Естественная компетентность | Регулируемый клеткой захват внеклеточной ДНК с помощью белков транспорта | Характерна для отдельных видов бактерий, например Streptococcus pneumoniae и Bacillus subtilis |
| Химическая компетентность | Ионы кальция или рубидия уменьшают электростатическое отталкивание ДНК и поверхности клетки | Применяется для подготовки лабораторных штаммов, особенно Escherichia coli |
| Электрокомпетентность | Электрический импульс кратковременно повышает проницаемость мембраны | Позволяет вводить крупные плазмиды и часто обеспечивает высокую эффективность трансформации |
| Тепловой шок | Кратковременное изменение температуры способствует прохождению плазмиды через мембрану после химической обработки | Типичный этап протокола трансформации химически компетентных клеток |
| Селективный маркер плазмиды | Экспрессия гена устойчивости или другого маркерного гена позволяет отличить трансформированные клетки | Используется для отбора колоний на селективной питательной среде |
| Стабильный трансформант | Плазмида сохраняется и реплицируется в клетке либо интегрируется в хромосому | Подтверждается ростом при селекции, ПЦР, рестрикционным анализом или секвенированием |
Термин компетентные клетки относится именно к способности клетки принять экзогенную ДНК, а не к наличию у неё конкретной плазмиды. Эффективность трансформации оценивают числом колониеобразующих единиц на микрограмм введённой ДНК. Для корректной интерпретации результата необходимо учитывать жизнеспособность клеток, чистоту плазмидной ДНК и параметры процедуры введения.