2) конформационном полиморфизме нитей ДНК
3) предварительной обработке образцов ДНК бисульфитом натрия
4) использовании рестрикционных эндонуклеаз, чувствительных к метилированию остатков цитозина (+)
Метилчувствительная полимеразная цепная реакция основана на предварительном расщеплении геномной ДНК рестрикционными эндонуклеазами, активность которых зависит от метилирования цитозина в составе специфического сайта узнавания. При наличии метильной группы фермент не расщепляет соответствующий участок, поэтому матрица сохраняется и может амплифицироваться. Неметилированный участок, напротив, разрушается рестриктазой, что приводит к отсутствию или выраженному снижению продукта ПЦР.
Для интерпретации результата обычно сравнивают амплификацию после обработки метилчувствительным ферментом с амплификацией исходной, нерасщеплённой ДНК; применяют также контроль полноты рестрикции и, при необходимости, метилнечувствительную изошизомерную рестриктазу. Метод позволяет определить метилирование только в пределах сайтов узнавания используемого фермента и чаще имеет качественный или полуколичественный характер. Бисульфитная обработка является основой другого подхода — бисульфит-специфической ПЦР или бисульфитного секвенирования, поэтому она не соответствует данному принципу.
| Метод | Принцип | Интерпретация и особенности |
|---|---|---|
| Метилчувствительная ПЦР (MSRE-PCR) | Расщепление ДНК рестриктазой, чувствительной к метилированию, с последующей амплификацией сохранившегося фрагмента | Амплификация после рестрикции указывает на сохранение метилированного сайта; результат зависит от полноты расщепления |
| Метилспецифическая ПЦР (MSP) | Конверсия неметилированных цитозинов бисульфитом натрия с последующей ПЦР с метил- и неметилспецифичными праймерами | Различает метилированные и неметилированные последовательности по избирательной амплификации |
| Бисульфитное секвенирование | Бисульфитная конверсия и определение последовательности методом секвенирования | Позволяет оценивать метилирование отдельных CpG-позиций, но требует более сложного анализа и контроля качества конверсии |
| Пиросеквенирование после бисульфитной обработки | Количественное считывание включения нуклеотидов в конвертированной ДНК | Даёт процент метилирования в заданных CpG-участках; применимо для ограниченного числа локусов |
| Метилирующий микрочип | Гибридизация бисульфит-конвертированной ДНК с набором зондов к множеству CpG-сайтов | Позволяет исследовать широкий набор локусов, но охватывает только участки, представленные на платформе |
| Метилирование-специфическая количественная ПЦР | Амплификация бисульфит-конвертированной ДНК с флуоресцентной регистрацией сигнала | Оценивает относительное содержание метилированной ДНК, однако требует валидированных стандартов и контролей |
Ключевым диагностическим признаком в MSRE-PCR является сохранение амплифицируемой матрицы после действия метилчувствительной рестриктазы. Отсутствие продукта может отражать неметилированное состояние участка, но также бывает следствием недостаточного количества ДНК или ингибирования ПЦР. Поэтому обязательны внутренние контроли и подтверждение эффективности рестрикции. Метод особенно удобен для анализа заранее выбранных CpG-содержащих рестрикционных сайтов, но не предназначен для полного картирования метилома.