2) микроматричного анализа
3) MLPA
4) секвенирования по Сэнгеру (+)
Метод обрыва цепи лежит в основе секвенирования по Сэнгеру. В ходе реакции ДНК-полимераза синтезирует комплементарную цепь на матрице, используя обычные дезоксинуклеотидтрифосфаты и небольшую долю меченых дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ddNTP). Дидезоксинуклеотиды не имеют 3′-гидроксильной группы, необходимой для присоединения следующего нуклеотида, поэтому их включение вызывает терминацию, то есть прекращение синтеза цепи.
В современной версии метода применяется циклосеквенирование в одной реакционной смеси с флуоресцентно мечеными ddNTP. Образуется набор фрагментов различной длины, каждый из которых заканчивается определённым нуклеотидом. После разделения фрагментов капиллярным электрофорезом регистрируется флуоресцентный сигнал, а последовательность нуклеотидов восстанавливается по порядку фрагментов. Метод особенно пригоден для анализа отдельных генов, подтверждения вариантов, выявленных другими способами, и выявления точечных замен или небольших инделов.
| Метод | Основной молекулярный принцип | Типичный диагностический результат | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|
| Секвенирование по Сэнгеру | Терминация синтеза при включении флуоресцентного ddNTP, последующий капиллярный электрофорез | Определение последовательности нуклеотидов в исследуемом фрагменте; выявление SNV и небольших инделов | Ограниченная длина прочтения и низкая чувствительность к низкоуровневому мозаицизму |
| ПЦР в реальном времени | Накопление ампликона регистрируется по флуоресценции в каждом цикле амплификации | Количественное определение нуклеиновой кислоты или выявление заданной мишени | Обычно не устанавливает полную нуклеотидную последовательность фрагмента |
| Микроматричный анализ | Гибридизация исследуемой ДНК с множеством фиксированных олигонуклеотидных зондов | Параллельный анализ известных вариантов экспрессии или копийности геномных участков | Зависит от заранее спроектированных зондов и плохо выявляет новые варианты последовательности |
| MLPA | Гибридизация пар зондов, их лигирование и последующая мультиплексная ПЦР с оценкой размера и интенсивности продуктов | Определение делеций и дупликаций отдельных экзонов или генов по изменению дозы сигнала | Не предназначена для полноценного чтения последовательности и большинства точечных замен |
| Массив сравнительной геномной гибридизации | Конкурентная гибридизация ДНК пациента и контроля с последующей оценкой соотношения сигналов | Выявление микроделеций, микродупликаций и изменений числа копий | Не обнаруживает сбалансированные перестройки и большинство вариантов на уровне одного нуклеотида |
| Массивное параллельное секвенирование | Одновременное чтение большого числа фрагментов с использованием циклического синтеза и регистрации сигналов | Панельное, экзомное или геномное исследование множества генов | Требует биоинформатической обработки и подтверждения части клинически значимых вариантов |
Принципиальным отличием секвенирования по Сэнгеру является не просто амплификация ДНК, а управляемое прекращение синтеза при включении ddNTP. В электрофореграмме гетерозиготная замена обычно проявляется двумя пиками в одной позиции, тогда как небольшая гетерозиготная делеция может приводить к смещению картины сигналов после места варианта. Метод сохраняет значение как точный способ верификации вариантов, особенно при исследовании одного или нескольких участков гена.