2) полиморфизмом длин амплификационных фрагментов
3) полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (+)
4) фрагментарным анализом
Правильный ответ — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, RFLP). Метод основан на применении рестрикционных эндонуклеаз — ферментов, распознающих определённые короткие последовательности ДНК и расщепляющих молекулу в строго заданных участках. Если точечная замена, делеция или вставка изменяет сайт рестрикции либо расстояние между сайтами, после расщепления образуются фрагменты иной длины.
В классическом варианте исследуемую ДНК обрабатывают выбранной рестриктазой, разделяют полученные фрагменты электрофорезом и идентифицируют их по размеру; исторически для визуализации использовали Southern blotting. В современной практике часто применяют PCR-RFLP: амплифицируют нужный участок генома, расщепляют ампликон рестриктазой и сопоставляют электрофоретический профиль с ожидаемыми вариантами. Наличие или отсутствие определённого фрагмента позволяет выявлять аллельный вариант и анализировать его наследование.
Принципиальным диагностическим признаком является различие паттернов фрагментов, обусловленное полиморфизмом последовательности ДНК. Метод применим для генотипирования известных мутаций, анализа сцепления маркеров с геном заболевания и определения носительства, однако требует предварительного знания варианта последовательности и наличия подходящей рестриктазы. Хромосомный микроматричный анализ выявляет преимущественно изменения числа копий, фрагментарный анализ оценивает длину флуоресцентно меченных ампликонов, а полиморфизм длин амплификационных фрагментов основан на селективной амплификации и не является классическим методом рестрикционного расщепления.
| Характеристика | Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов |
|---|---|
| Основной фермент | Рестрикционная эндонуклеаза, распознающая специфическую нуклеотидную последовательность |
| Молекулярная основа | Изменение сайта рестрикции или расстояния между сайтами вследствие замены, вставки или делеции |
| Последовательность исследования | Выделение ДНК, рестрикционное расщепление, электрофоретическое разделение и анализ профиля фрагментов |
| Современная модификация | PCR-RFLP: рестриктазой расщепляют предварительно амплифицированный участок ДНК |
| Результат | Различающийся набор полос или пиков, соответствующих фрагментам определённой длины |
| Основное применение | Генотипирование известных вариантов, анализ сцепления, определение носительства и подтверждение наследования аллеля |
| Ограничение | Необходимы известная последовательность-мишень и рестриктаза, способная различать исследуемые аллели |
ПДРФ относится к методам анализа вариабельности нуклеотидной последовательности по размеру продуктов рестрикции. Отсутствие или появление сайта расщепления непосредственно отражается на электрофоретическом профиле. При неизвестных генетических изменениях более информативными обычно становятся секвенирование или методы массового параллельного анализа. Тем не менее RFLP сохраняет значение как наглядный и относительно доступный способ исследования известных вариантов ДНК.