2) гибридизация меченых РНК зондов с фрагментами ДНК на мембранах (+)
3) электрофоретическое разделение фрагментов НК после обработки эндонуклеазами рестрикции
4) выявление белков на мембранах после электрофореза при помощи меченых зондов
Отмеченный вариант 2 отражает принцип метода Нозерн-блоттинга: меченый нуклеиновокислотный зонд выявляет на мембране комплементарную последовательность посредством специфической гибридизации. В классическом варианте сначала выделяют РНК, денатурируют ее и разделяют фрагменты по размеру в агарозном геле, затем переносят на нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану и фиксируют. После инкубации с меченым комплементарным зондом образуется двуцепочечный гибрид, а регистрируемый сигнал позволяет определить наличие, приблизительный размер и относительное количество исследуемой транскрипционной РНК.
Строго методически мишенью Нозерн-блоттинга являются фрагменты РНК, тогда как зонд может быть РНК- или ДНК-природы; поэтому указание в варианте 2 на фрагменты ДНК является неточностью формулировки. В учебном ключе этот вариант считается правильным, поскольку он передает суть мембранной гибридизации с использованием меченого РНК-зонда. Вариант 1 описывает Саузерн-блоттинг, предназначенный для анализа ДНК, вариант 3 — обычное электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов без этапа гибридизации, а вариант 4 — Вестерн-блоттинг белков с использованием антител.
Нозерн-анализ особенно информативен при изучении экспрессии генов, длины транскриптов, альтернативного сплайсинга, появления аномальных или слитых РНК. Специфичность метода определяется комплементарностью последовательностей, а достоверность результата зависит от сохранности РНК, качества переноса на мембрану, условий отмывки и правильного контроля загрузки образцов.
| Метод | Исследуемая мишень | Реагент выявления | Основной результат |
|---|---|---|---|
| Нозерн-блоттинг | Фрагменты РНК, разделенные по размеру | Меченый комплементарный РНК- или ДНК-зонд | Наличие, размер и относительная экспрессия транскрипта, выявление изоформ |
| Саузерн-блоттинг | Фрагменты ДНК после рестрикции | Меченый нуклеиновокислотный зонд | Делеции, перестройки, изменения числа копий, полиморфизмы рестрикционных фрагментов |
| Вестерн-блоттинг | Белки | Специфические антитела, обычно с ферментной или флуоресцентной меткой | Наличие, молекулярная масса и относительное количество белка |
| Рестрикционный электрофорез | Фрагменты ДНК после обработки эндонуклеазами рестрикции | Флуоресцентный краситель для визуализации нуклеиновых кислот | Размер и распределение фрагментов; этап гибридизации отсутствует |
| ОТ-ПЦР и количественная ПЦР | кДНК, полученная из матричной РНК | Специфические праймеры и флуоресцентный сигнал | Высокочувствительное обнаружение и количественная оценка экспрессии |
| FISH | ДНК в фиксированных клетках или хромосомах | Флуоресцентные ДНК-зонды | Локализация последовательности, амплификация, делеция или перестройка локуса |
В современной практике Нозерн-блоттинг применяется преимущественно тогда, когда важно одновременно оценить размер транскрипта и характер его экспрессии. Для точного количественного анализа чаще используют ОТ-ПЦР в реальном времени, а для широкого профилирования транскриптома — RNA-seq. Независимо от выбранной технологии, интерпретация должна учитывать качество РНК и наличие положительного и отрицательного контролей. Ключевой отличительный признак Нозерн-метода — анализ РНК с помощью комплементарной гибридизации после электрофоретического разделения и переноса на мембрану.