2) изоэлектрофокусирование в агарозном или полиакриамидном геле
3) иммунофиксация и окраска
4) спектрофотометрия
Электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле является классическим способом визуализации амплифицированных фрагментов ДНК после ПЦР. Молекулы ДНК имеют отрицательный заряд благодаря фосфатным группам и в электрическом поле перемещаются к положительному электроду. Пористая структура геля разделяет фрагменты преимущественно по длине: короткие ампликоны мигрируют быстрее и дальше, а крупные — медленнее. После окрашивания интеркалирующими флуоресцентными красителями, например бромидом этидия или безопасными аналогами, продукты выявляют в ультрафиолетовом или синем свете.
Результат оценивают по наличию полосы ожидаемого размера относительно ДНК-маркера. Одна четкая полоса соответствующей длины свидетельствует о преимущественном образовании целевого ампликона; дополнительные полосы могут указывать на неспецифическую амплификацию, а низкомолекулярная полоса — на образование праймер-димеров. Агарозный гель чаще используют для разделения фрагментов среднего и большого размера, тогда как полиакриламидный обеспечивает более высокое разрешение коротких продуктов. Изоэлектрофокусирование предназначено главным образом для разделения белков по изоэлектрической точке, иммунофиксация основана на реакции антиген–антитело, а спектрофотометрия определяет суммарное поглощение раствора и не показывает размер отдельных ампликонов.
| Метод | Основной объект | Принцип разделения или выявления | Информативность при анализе продуктов ПЦР |
|---|---|---|---|
| Электрофорез в агарозном геле | Фрагменты ДНК | Миграция отрицательно заряженной ДНК в электрическом поле с разделением по длине | Визуализация ампликона, оценка его размера, специфичности и количества полос |
| Электрофорез в полиакриламидном геле | Короткие фрагменты ДНК и РНК | Разделение в более мелкопористой матрице с высоким разрешением | Точный анализ небольших ампликонов и продуктов, близких по размеру |
| Изоэлектрофокусирование | Белки | Фокусирование молекул в градиенте pH в точке их изоэлектрического равновесия | Не является стандартным методом разделения ДНК-продуктов ПЦР |
| Иммунофиксация | Белки, преимущественно иммуноглобулины | Связывание определённых белков специфическими антителами с последующей фиксацией и окраской | Не предназначена для непосредственного выявления ампликонов |
| Спектрофотометрия | Растворы нуклеиновых кислот | Измерение оптической плотности на определённой длине волны | Оценивает общую концентрацию и чистоту ДНК, но не размер и специфичность ампликона |
| ДНК-маркер молекулярной массы | Стандартный набор фрагментов ДНК | Сопоставление положения полос исследуемого образца с фрагментами известной длины | Позволяет приблизительно определить размер продукта ПЦР на геле |
Гель-электрофорез особенно полезен для конечной оценки качественной ПЦР, когда требуется подтвердить наличие ампликона заданной длины. Отсутствие полосы может быть связано с отсутствием мишени, ингибированием реакции или технической ошибкой, поэтому результат сопоставляют с положительным и отрицательным контролями. Для количественной оценки динамики амплификации применяют ПЦР в реальном времени, а для точного определения последовательности — секвенирование. Таким образом, электрофоретическая полоса отражает не только факт образования продукта, но и его соответствие ожидаемому размеру.