2) цитрат натрия
3) ЭДТА
4) фторид натрия
Для кариотипирования периферической или пуповинной крови используют пробирку с гепарином, чаще с натриевой солью. Гепарин активирует антитромбин III и подавляет тромбин и фактор Xa, предотвращая образование фибринового сгустка без выраженного связывания ионов кальция. Это позволяет сохранить жизнеспособность лейкоцитов, прежде всего Т-лимфоцитов, необходимых для последующего культивирования.
В лаборатории клетки крови стимулируют к делению, обычно фитогемагглютинином, затем останавливают митоз на стадии метафазы и исследуют хромосомный набор. Качество кариотипа зависит от количества жизнеспособных клеток и их способности к пролиферации, поэтому материал должен быть несвернувшимся, доставлен в лабораторию в короткие сроки и не подвергаться замораживанию. Гепарин в рекомендуемой концентрации минимально влияет на клеточную культуру и потому является оптимальным антикоагулянтом для цитогенетического исследования.
ЭДТА и цитрат натрия связывают кальций, что может нарушать функциональное состояние клеток и снижать эффективность их митотической стимуляции; кроме того, цитрат вносит дополнительное разведение образца. Фторид натрия предназначен главным образом для торможения гликолиза при исследовании глюкозы и не используется для получения метафазных хромосом.
| Антикоагулянт или условие | Основной механизм | Пригодность для кариотипирования | Практическое значение |
|---|---|---|---|
| Гепарин | Усиление действия антитромбина III, ингибирование тромбина и фактора Xa | Оптимален | Сохраняет жизнеспособность лимфоцитов и их способность к пролиферации |
| ЭДТА | Хелатирование ионов кальция | Не рекомендуется | Может снижать жизнеспособность клеток и эффективность митотической стимуляции; чаще применяется для гематологических и молекулярных исследований |
| Цитрат натрия | Обратимое связывание кальция с последующим разведением образца | Не является стандартным | Подходит преимущественно для исследований системы гемостаза, а не для культивирования лимфоцитов |
| Фторид натрия | Ингибирование гликолиза | Не пригоден | Используется главным образом при взятии крови для определения глюкозы |
| Свернувшаяся кровь | Формирование фибринового сгустка и изменение клеточного состава | Непригодна | Клетки распределяются неравномерно, а материал теряет ценность для стандартной культуры |
| Срок и условия доставки | Сохранение метаболически активных клеток вне организма | Критически важны | Материал направляют как можно быстрее, обычно при комнатной температуре, без замораживания и перегрева |
Выбор антикоагулянта определяется не только предотвращением свертывания, но и необходимостью сохранить клетки для культуры. Гепаринизированная кровь обеспечивает получение достаточного числа метафаз с четко визуализируемыми хромосомами. Неподходящий антикоагулянт может привести к слабой пролиферации, малому числу метафаз и невозможности интерпретировать результат. Поэтому для цитогенетической диагностики предпочтителен именно гепарин.