2) преципитация-лизис-отмывка от примесей
3) лизис-отмывка от примесей-преципитация (+)
4) денатурация-отмывка от примесей-преципитация
Правильная последовательность основана на поэтапном разделении клеточных компонентов. Сначала проводят лизис — разрушение клеточных и ядерных мембран химическим, ферментативным или механическим способом, в результате чего нуклеиновые кислоты переходят в раствор. Одновременно инактивируются нуклеазы, способные разрушать ДНК и РНК.
После лизиса необходимо удалить белки, липиды, остатки мембран, полисахариды и другие ингибиторы последующих реакций. Это выполняют с помощью органической экстракции, сорбции на силикагеле или магнитных частицах, солевого разделения и отмывки. Только после очистки проводят преципитацию: добавление соли и этанола или изопропанола снижает растворимость нуклеиновых кислот и переводит их в осадок, который затем отделяют центрифугированием.
Преципитация до лизиса невозможна, поскольку нуклеиновые кислоты остаются внутри клеток и недоступны для эффективного выделения. Денатурация является не самостоятельной обязательной стадией, а частным компонентом лизиса или удаления белков; её выделение в начало схемы не отражает универсальный протокол экстракции.
| Этап | Основная цель | Типичные средства | Результат или возможная ошибка |
|---|---|---|---|
| Предварительная подготовка | Разрушение агрегатов и стандартизация образца | Гомогенизация, суспендирование, ферментативная обработка | Однородный материал; неполная гомогенизация снижает выход |
| Лизис | Разрушение клеточных и ядерных мембран, высвобождение ДНК или РНК | Детергенты, протеиназа K, хаотропные соли, механическое воздействие | Нуклеиновые кислоты переходят в лизат; недостаточный лизис приводит к низкому выходу |
| Удаление примесей | Отделение белков, липидов, мембранных фрагментов и ингибиторов | Фенол-хлороформ, солевое разделение, силикагель, магнитные частицы | Формируется очищенная фракция; остаточный этанол или соли ингибируют ПЦР |
| Преципитация | Концентрирование и осаждение нуклеиновых кислот | Этанол или изопропанол в присутствии ацетата натрия либо другой соли | Образуется осадок ДНК или РНК; чрезмерное соосаждение солей ухудшает чистоту |
| Отмывка осадка | Удаление избытка солей и растворителей | Холодный 70% этанол, последующее высушивание | Повышается чистота препарата; пересушивание затрудняет растворение |
| Растворение и контроль качества | Получение стабильного препарата для анализа | Вода без нуклеаз или буфер TE, спектрофотометрия, флуориметрия, оценка целостности | Определяются концентрация, чистота и степень деградации нуклеиновых кислот |
В современных наборах на основе колонок или магнитных частиц финальная концентрация часто достигается не спиртовой преципитацией, а элюцией с сорбента. Однако общий принцип сохраняется: сначала необходимо высвободить нуклеиновые кислоты, затем очистить их от ингибирующих примесей и только после этого получить концентрированный препарат. Качество выделения оценивают по выходу, чистоте и сохранности высокомолекулярной ДНК или интактной РНК.