2) SNV
3) химерных транскриптов
4) коротких инделов (до 10 п.о.)
При нейрофиброматозе 1-го типа (НФ1), обусловленном патогенными вариантами гена NF1, MLPA применяют для выявления изменений числа копий участков ДНК — прежде всего экзонных и протяжённых делеций, а также дупликаций. Метод основан на гибридизации пар зондов с соседними участками исследуемой последовательности и их последующем лигировании. После лигирования фрагменты амплифицируются универсальными праймерами, а интенсивность полученных пиков сравнивается с контрольными образцами.
При гетерозиготной делеции соответствующего экзона или группы экзонов количество лигированных зондов уменьшается, поэтому регистрируется снижение амплификационного сигнала примерно до 50% от контрольного уровня. Такой подход особенно информативен при крупных внутригенных делециях и делециях всего гена NF1, которые могут не выявляться при стандартном секвенировании. MLPA не предназначена для обнаружения большинства однонуклеотидных вариантов, коротких инделов или химерных транскриптов: для их поиска требуются другие молекулярно-генетические методы.
| Метод | Основная мишень | Тип выявляемых изменений | Роль при НФ1 |
|---|---|---|---|
| MLPA | Экзоны и отдельные участки гена NF1 | Делеции и дупликации одного или нескольких экзонов, крупные делеции гена | Определение вариантов числа копий при отрицательном или неполном результате секвенирования |
| NGS-панель | Кодирующие последовательности и участки сплайсинга | SNV и небольшие инделы; частично — варианты сплайсинга | Основной метод поиска точечных и малых вариантов в NF1 |
| Секвенирование по Сэнгеру | Отдельные экзоны или варианты-кандидаты | SNV и небольшие инделы | Подтверждение находок NGS и анализ отдельных участков |
| Хромосомный микроматричный анализ | Геномные участки различного размера | Микроделеции и микродупликации, включая крупные перестройки | Оценка геномного дисбаланса, особенно при крупной делеции NF1 и множественных аномалиях |
| RT-PCR и анализ РНК | Транскрипт гена | Аномальный сплайсинг, дефектные или химерные транскрипты | Уточнение функционального эффекта вариантов, влияющих на сплайсинг |
| qPCR или ddPCR | Выбранный экзон или геномный участок | Изменение числа копий, иногда мозаицизм | Подтверждение делеции/дупликации и количественная оценка копий |
Обнаружение крупной делеции NF1 может иметь клиническое значение, поскольку такие варианты нередко связаны с более тяжёлым фенотипом, ранним появлением симптомов и повышенным риском осложнений. Результат MLPA следует интерпретировать с учётом клинических критериев НФ1, включая пятна цвета кофе с молоком , кожные нейрофибромы, подмышечное или паховое веснушкование и поражение зрительного нерва. Выявленный вариант числа копий обычно подтверждают независимым методом и оценивают его происхождение у родителей. При отрицательном результате MLPA заболевание не исключается, поскольку причиной могут быть точечные варианты, небольшие инделы или изменения сплайсинга.