2) коротких инделов (до 10 п.о.)
3) SNV
4) протяженных делеций (+)
Туберозный склероз обусловлен патогенными вариантами генов TSC1 и TSC2, кодирующих белки гамартина и туберина, регулирующие сигнальный путь mTOR. Помимо однонуклеотидных замен и небольших инделов, у пациентов встречаются изменения числа копий — делеции или дупликации отдельных экзонов, нескольких экзонов либо всего гена. Такие варианты могут приводить к недостаточной продукции белка и формированию характерных гамартом и органных поражений.
MLPA основана на гибридизации пар специфических зондов с соседними участками ДНК, их последующей лигировании и количественной ПЦР с универсальными праймерами. При делеции соответствующего участка зонд не лигируется, поэтому интенсивность амплифицированного фрагмента снижается; при дупликации она увеличивается. Анализ нескольких зондов одновременно позволяет выявлять протяженные экзонные и геномные делеции в TSC1 или TSC2, включая варианты, которые могут быть пропущены при исследовании отдельных последовательностей.
Таким образом, отмеченный ответ соответствует основному назначению MLPA при туберозном склерозе — поиску крупных делеций и других нарушений числа копий. SNV и короткие инделы обычно выявляют методом секвенирования нового поколения или методом Сэнгера, а химерные транскрипты требуют анализа РНК, например ОТ-ПЦР или RNA-seq. MLPA не определяет точную нуклеотидную последовательность удаленного участка и обнаруживает только те изменения, для которых в наборе предусмотрены соответствующие зонды.
| Метод | Основные выявляемые изменения | Применение при туберозном склерозе | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|
| MLPA | Делеции и дупликации отдельных экзонов, нескольких экзонов или всего гена | Поиск крупных вариантов числа копий в TSC1 и TSC2 | Не предназначена для систематического поиска SNV и малых инделов |
| NGS-панель генов | SNV, короткие инделы; при соответствующем анализе — CNV | Основной метод поиска последовательностных вариантов в TSC1/TSC2 | Чувствительность к мозаицизму и крупным перестройкам зависит от покрытия и алгоритмов |
| Секвенирование по Сэнгеру | Подтверждение известных SNV и небольших инделов | Валидация варианта, обнаруженного при скрининговом исследовании | Низкая эффективность для больших генов и протяженных делеций |
| ОТ-ПЦР и RNA-seq | Химерные транскрипты, нарушения сплайсинга, аномальная экспрессия | Исследование функциональных последствий отдельных вариантов | Требуют доступного и качественного образца РНК; не являются стандартным методом поиска CNV |
| Хромосомный микроматричный анализ | Крупные делеции и дупликации по всему геному | Поиск геномных CNV при неясном синдроме или множественных аномалиях | Ограниченное разрешение и отсутствие информации о точных точечных заменах |
| qPCR или ddPCR | Количественная оценка заранее выбранного участка ДНК | Подтверждение конкретной делеции или дупликации | Исследует ограниченное число мишеней и не заменяет комплексный поиск вариантов |
Отрицательный результат MLPA не исключает туберозный склероз, поскольку заболевание может быть вызвано SNV, малым инделом, глубоким интронным вариантом или низкоуровневым мозаицизмом. При сохраняющемся клиническом подозрении проводят секвенирование TSC1 и TSC2 с оценкой покрытия и возможности выявления мозаичных вариантов. Выявление патогенного варианта в одном из этих генов имеет диагностическое значение даже при неполном наборе клинических признаков. окончательная клиническая диагностика также опирается на международные критерии, включающие характерные большие и малые признаки заболевания.