2) праймеров к нескольким генам-мишеням (+)
3) dNTP, меченных различными флуорофорами
4) системы TaqMan
Мультиплексная ПЦР в реальном времени предназначена для одновременной амплификации и регистрации нескольких различных нуклеотидных последовательностей в одной реакционной пробирке. Для этого в реакционную смесь включают несколько пар специфических праймеров, каждая из которых комплементарна своей генетической мишени. Таким образом, принципиальным признаком мультиплексного формата является наличие праймеров к нескольким генам или участкам генома, амплифицируемым параллельно в ходе одного температурного протокола.
При количественной или качественной регистрации продуктов амплификации отдельные мишени обычно различают с помощью последовательностно-специфических флуоресцентных зондов, меченных разными флуорофорами. Система TaqMan часто применяется для такой детекции, однако сама по себе она является способом флуоресцентной регистрации и может использоваться также в обычной одноплексной ПЦР. Интеркалирующий краситель SYBR Green связывается практически с любой двуцепочечной ДНК и не позволяет надежно различать несколько одновременно образующихся ампликонов по отдельным каналам, а использование флуоресцентно меченных dNTP не относится к стандартному принципу мультиплексной ПЦР в реальном времени.
| Подход | Основной принцип | Применимость к мультиплексной ПЦР |
|---|---|---|
| Одноплексная ПЦР | Одна пара праймеров амплифицирует одну мишень | Одновременное определение нескольких генов не предусмотрено |
| Мультиплексная ПЦР | Несколько пар праймеров направлены к разным генам или локусам | Основной принцип мультиплексного формата |
| SYBR Green | Флуоресценция возникает при связывании красителя с двуцепочечной ДНК | Ограниченно пригоден для различения нескольких ампликонов из-за неспецифичности сигнала |
| TaqMan-зонды | Специфические олигонуклеотидные зонды дают флуоресцентный сигнал при амплификации | Широко применяются для специфической регистрации отдельных мишеней |
| Разные флуорофоры | Каждому специфическому зонду соответствует отдельный спектральный канал | Позволяют идентифицировать несколько ампликонов в одной реакции |
| Меченные dNTP | Флуорофор непосредственно связан с нуклеотидом | Не является стандартным способом дифференциации мишеней в диагностической real-time PCR |
| Внутренний контроль | Дополнительная пара праймеров и зонд контролируют экстракцию и амплификацию | Часто включается как отдельная мишень мультиплексной реакции |
При разработке мультиплексной ПЦР необходимо подбирать праймеры с совместимыми температурами отжига и минимизировать образование праймер-димеров и неспецифических продуктов. Для зондовой детекции флуорофоры выбирают с учетом спектральных возможностей амплификатора и минимального перекрытия каналов регистрации. В клинической лабораторной генетике такой формат позволяет одновременно выявлять несколько мутаций, аллелей, генов или контрольных последовательностей при меньшем расходе биоматериала и реагентов. Достоверность результата зависит не только от флуоресцентной системы, но прежде всего от специфичности и эффективности каждой пары праймеров в общей реакции.