2) кинированием
3) лигированием (+)
4) рестрикцией
Лигирование — это ферментативное соединение фрагментов нуклеиновых кислот с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи. Реакцию катализируют ДНК-лигазы или РНК-лигазы: они соединяют 3′-гидроксильную группу одного фрагмента с 5′-фосфатной группой другого. В результате устраняется разрыв в сахарофосфатном остове цепи; лигирование возможно как между двумя молекулами, так и при восстановлении одноцепочечного разрыва в пределах одной молекулы.
Механизм включает активацию фермента аденилированием: у лигазы образуется высокоэнергетичный промежуточный комплекс с AMP, который затем переносится на 5′-фосфатный конец субстрата. После сближения совместимых концов формируется фосфодиэфирная связь, а AMP высвобождается. Для разных лигаз источником энергии служат ATP или NAD+; реакция имеет большое значение при репарации ДНК, рекомбинантном клонировании, подготовке библиотек для секвенирования и соединении адаптеров с фрагментами нуклеиновых кислот.
| Реакция | Фермент или фактор | Основное превращение | Результат для нуклеиновой кислоты |
|---|---|---|---|
| Лигирование | ДНК-лигаза, РНК-лигаза | Соединение 3′-OH и 5′-фосфата | Образование фосфодиэфирной связи и сшивание фрагментов |
| Аденилирование | Лигаза, аденилил-трансфераза и другие ферменты | Перенос остатка AMP на фермент или субстрат | Активация промежуточного соединения; сама по себе не означает сшивание цепей |
| Кинирование, или фосфорилирование | Киназа | Перенос фосфатной группы, обычно с ATP | Формирование 5′-фосфатного конца, необходимого для последующего лигирования |
| Рестрикция | Рестрикционная эндонуклеаза | Гидролитическое расщепление фосфодиэфирной связи в специфическом участке | Получение фрагментов ДНК с тупыми или липкими концами |
| Полимеризация | ДНК-полимераза или РНК-полимераза | Последовательное присоединение нуклеотидов к растущей цепи | Удлинение цепи по матричному принципу с образованием новых фосфодиэфирных связей |
| Экзонуклеолиз | Экзонуклеаза | Гидролитическое удаление нуклеотидов с 5′- или 3′-конца | Укорачивание цепи, противоположное по направленности лигированию |
Ключевой диагностический признак данной реакции — восстановление непрерывности сахарофосфатного остова с формированием новой ковалентной связи между ранее раздельными концами. Для эффективного лигирования необходимы доступные и химически совместимые концы, обычно 3′-OH и 5′-фосфат. Если 5′-конец не фосфорилирован, его предварительно обрабатывают полинуклеотидкиназой. Поэтому именно лигирование соответствует образованию фосфодиэфирной связи между молекулами нуклеиновых кислот.