2) комета-тест
3) прямое секвенирование по Сэнгеру
4) цифровая ПЦР (+)
Цифровая ПЦР является современным методом выявления мутаций в циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA), выделенной преимущественно из плазмы крови. Метод основан на разделении образца на тысячи независимых микрореакций, в каждой из которых после амплификации регистрируется наличие или отсутствие целевой последовательности. С использованием аллель-специфичных праймеров и флуоресцентных зондов можно избирательно выявлять известную мутацию на фоне значительного избытка ДНК дикого типа.
Количество положительных и отрицательных реакций анализируют с применением пуассоновской статистики, что позволяет рассчитать абсолютное число копий мутантной и нормальной последовательностей и определить долю мутантного аллеля. Благодаря высокой аналитической чувствительности цифровая ПЦР подходит для обнаружения низкочастотных вариантов в ctDNA, в том числе при минимальной остаточной болезни, мониторинге ответа на лечение и выявлении резистентных мутаций. На практике чувствительность зависит от качества плазмы, количества выделенной ДНК, дизайна теста и предварительно установленного предела обнаружения.
Клеточное культивирование требует жизнеспособных клеток и не предназначено для прямого анализа свободно циркулирующей ДНК. Комета-тест выявляет повреждения и фрагментацию ДНК, но не идентифицирует конкретные нуклеотидные замены. Секвенирование по Сэнгеру эффективно при достаточно высокой доле мутантного аллеля, однако обычно недостаточно чувствительно для поиска редких мутаций в плазменной ctDNA; для широкого поиска неизвестных вариантов чаще применяют секвенирование нового поколения.
| Метод | Основной принцип | Возможности при анализе ctDNA | Ограничения |
|---|---|---|---|
| Цифровая ПЦР | Партиционирование образца на множество микрореакций и подсчёт положительных реакций с пуассоновской коррекцией | Высокочувствительное количественное выявление заранее известных мутаций и низкой мутантной фракции | Требует валидированного таргетного дизайна; не предназначена для одновременного поиска всех неизвестных вариантов |
| Секвенирование по Сэнгеру | Терминационная регистрация последовательности фрагмента ДНК | Подтверждение вариантов при относительно высокой концентрации мутантного аллеля | Ограниченная чувствительность при низкой доле ctDNA и небольшом количестве копий мишени |
| Секвенирование нового поколения | Массивное параллельное чтение множества фрагментов ДНК | Панельное или комплексное исследование множества генов, поиск различных типов вариантов | Зависит от глубины покрытия, качества библиотеки и биоинформатической фильтрации; может быть менее экономично для одной известной мутации |
| Аллель-специфическая обычная ПЦР | Амплификация преимущественно мутантной или нормальной последовательности | Быстрый качественный скрининг отдельных известных мутаций | Обычно уступает цифровой ПЦР по точности количественной оценки и воспроизводимости при очень низкой мутантной фракции |
| Клеточное культивирование | Размножение жизнеспособных клеток in vitro | Может использоваться для функциональных и лекарственных исследований клеточных моделей | Не является прямым методом выявления мутаций в свободной циркулирующей опухолевой ДНК; возможен отбор клонов |
| Комета-тест | Электрофоретическая оценка миграции фрагментов ДНК из отдельных клеток | Выявление одно- и двунитевых разрывов и общей генотоксичности | Не определяет конкретную последовательность или нуклеотидную мутацию |
Цифровая ПЦР особенно информативна при мониторинге динамики ctDNA: уменьшение мутантной фракции может соответствовать молекулярному ответу на терапию, а её повторное увеличение — рецидиву или появлению резистентного клона. Интерпретация результата должна учитывать клинические данные, исходный генотип опухоли и контрольные образцы. Отрицательный результат не исключает опухолевый процесс при низкой концентрации ctDNA или недостаточной чувствительности теста. Для корректного заключения необходимы стандартизованные этапы забора плазмы, выделения ДНК и аналитической валидации метода.