2) эмульсионную ПЦР в микросфере
3) мостиковую ПЦР (+)
4) реакцию пиросеквенирования
В платформе MiSeq (Illumina) используется клональная амплификация фрагментов ДНК методом мостиковой ПЦР на поверхности проточной ячейки (flow cell). Библиотечные фрагменты, снабжённые адаптерами, гибридизуются с олигонуклеотидами, иммобилизованными на поверхности ячейки. Одна цепь изгибается и образует мостик с соседним олигонуклеотидом, после чего достраивается ДНК-полимеразой; многократное повторение циклов денатурации и синтеза формирует клональные кластеры из идентичных молекул.
После образования кластеров проводится секвенирование методом синтеза (sequencing by synthesis). В каждом цикле в реакцию добавляются флуоресцентно меченные обратимо терминирующие нуклеотиды, содержащие блокирующую группу, поэтому к растущей цепи присоединяется только один нуклеотид. Регистрация флуоресцентного сигнала позволяет определить его тип, затем блок удаляется и цикл повторяется. Именно сочетание мостиковой амплификации на flow cell и флуоресцентного SBS характерно для MiSeq.
| Платформа или метод | Где находится матрица | Способ амплификации | Принцип регистрации сигнала | Ключевой отличительный признак |
|---|---|---|---|---|
| Illumina MiSeq | Поверхность проточной ячейки | Мостиковая амплификация с образованием кластеров | Флуоресценция обратимо терминирующих нуклеотидов | Секвенирование методом синтеза |
| Ion Torrent | Микросферы в микролунках | Эмульсионная ПЦР на микросферах | Изменение pH при высвобождении ионов водорода | Ионное полупроводниковое секвенирование |
| Roche 454 | Микросферы в микролунках | Эмульсионная ПЦР | Регистрация пирофосфата и последующей световой реакции | Пиросеквенирование |
| SOLiD | Клональные матрицы на микросферах | В основном эмульсионная ПЦР | Флуоресценция при лигировании олигонуклеотидов | Секвенирование методом лигирования |
| Капиллярное секвенирование по Сэнгеру | Раствор или капилляр после амплификации | Циклическая амплификация; клональные кластеры не формируются | Флуоресцентно меченные дидезоксинуклеотиды | Электрофоретическое разделение фрагментов |
| Мостиковая амплификация | Олигонуклеотиды на твёрдой поверхности | Последовательное образование и копирование ДНК-мостиков | Не является самостоятельным способом детекции | Создаёт локальные клональные кластеры для последующего считывания |
Эмульсионная ПЦР принципиально отличается тем, что амплификация происходит в отдельных водно-масляных микрореакторах вокруг микросфер, а не на поверхности flow cell. Пиросеквенирование основано на выявлении пирофосфата и связано с другими химическими реакциями регистрации сигнала. Следовательно, для MiSeq правильным является вариант, обозначающий мостиковую ПЦР; последующее чтение последовательности выполняется флуоресцентным методом синтеза.