2) 1 этап
3) 2 этапа
4) 3 этапа (+)
Цикл полимеразной цепной реакции включает три последовательных этапа: денатурацию, отжиг праймеров и элонгацию. При денатурации двуцепочечная ДНК разделяется на отдельные цепи; во время отжига праймеры комплементарно связываются с целевыми участками матрицы; на этапе элонгации термостабильная ДНК-полимераза достраивает новые цепи в направлении 5′→3′. Такое чередование температур обеспечивает образование копий заданного фрагмента и объясняет правильность ответа 3 этапа .
Каждый последующий цикл использует продукты предыдущего цикла в качестве матриц, поэтому при идеальной эффективности количество амплифицированных молекул удваивается. В стандартной трехступенчатой ПЦР денатурация обычно проводится при 94–98 °C, отжиг — при температуре, зависящей от состава праймеров, а элонгация — преимущественно при 68–72 °C. Начальная денатурация и конечная элонгация являются дополнительными этапами всей постановки реакции, но не самостоятельными фазами повторяющегося цикла.
В некоторых протоколах применяют двухступенчатый режим, при котором отжиг праймеров и элонгация выполняются при одной температуре; это не отменяет биологической последовательности процессов, а лишь объединяет два температурных шага. Для количественной ПЦР принцип остается тем же: флуоресцентный сигнал регистрируется в ходе циклов, а значение порогового цикла отражает исходное количество целевой нуклеиновой кислоты.
| Этап или режим | Ориентировочные условия | Основной молекулярный процесс | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Денатурация | 94–98 °C | Разрыв водородных связей и разделение двухцепочечной ДНК на матричные цепи | Обеспечивает доступ праймеров к одноцепочечной матрице |
| Отжиг праймеров | Обычно 50–65 °C; зависит от температуры плавления праймеров | Гибридизация праймеров с комплементарными участками целевой последовательности | Определяет специфичность амплификации и границы продукта |
| Элонгация | Чаще 68–72 °C | Удлинение праймера термостабильной ДНК-полимеразой с включением дезоксирибонуклеотидов | Формирует новые копии диагностируемого фрагмента |
| Начальная денатурация | Повышенная температура, обычно 1–5 минут | Полное раскрытие исходной ДНК и активация некоторых ферментов hot-start | Подготавливает реакционную смесь, но не относится к повторяющемуся циклу |
| Конечная элонгация | Обычно 68–72 °C после последнего цикла | Завершение достройки неполных ампликонов | Повышает полноту формирования конечного продукта |
| Двухступенчатый режим | Отжиг и элонгация при одной температуре | Гибридизация праймеров и синтез цепи происходят в объединенном температурном шаге | Допустим для праймеров с подходящей температурой плавления и не изменяет состава основных процессов |
Таким образом, структурной единицей амплификации является последовательность из трех фаз, повторяемая заданное число раз. Специфичность реакции преимущественно определяется праймерами и условиями их отжига, а эффективность — активностью полимеразы, качеством матрицы и корректностью температурного режима. Нарушение любого из трех основных этапов может привести к снижению выхода продукта или появлению неспецифической амплификации.