2) количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (RT-PCR)
3) капельная цифровая полимеразная цепная реакция (DD-PCR)
4) полимеразная цепная реакция с рестрицированными фрагментами ДНК (RLFP)
Правильный ответ — полимеразная цепная реакция с вырожденным праймером (DOP-PCR). Вырожденный праймер содержит фиксированные нуклеотидные участки и участок с неопределёнными основаниями, благодаря чему может связываться со множеством комплементарных последовательностей геномной ДНК. В первых циклах используют условия пониженной строгости для случайного присоединения праймера, а затем повышают строгость отжига и проводят экспоненциальную амплификацию ранее синтезированных фрагментов.
При включении в реакцию меченых дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, например биотинилированных, флуоресцентно-меченых или радиоактивных, образуются многочисленные копии ДНК с встроенной меткой. Такой амплифицированный материал применяют как ДНК-зонд для молекулярной гибридизации, в том числе при флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), сравнительной геномной гибридизации и исследовании микродиссектированных хромосом. Поэтому принципиальное свойство DOP-PCR в данном контексте — сочетание неспецифического охвата большого числа участков генома с одновременным введением детектируемой метки.
| Метод | Основной принцип | Типичный результат и назначение |
|---|---|---|
| DOP-PCR | Амплификация множества участков ДНК вырожденными праймерами с последующим включением меченых нуклеотидов | Получение меченого ДНК-зонда, включая зонды для FISH и сравнительной геномной гибридизации |
| Обычная ПЦР с праймерами к конкретному локусу | Избирательное копирование одной известной последовательности | Получение специфического ампликона; может использоваться для его последующего мечения, но не обеспечивает широкого геномного охвата |
| qPCR в реальном времени | Регистрация накопления продукта по флуоресценции в каждом цикле и расчёт исходного количества матрицы | Количественное определение ДНК или кДНК; флуоресцентный сигнал служит для детекции, а не обязательно для получения самостоятельного ДНК-зонда |
| RT-PCR | Обратная транскрипция РНК в кДНК с последующей амплификацией | Исследование экспрессии генов или выявление РНК-содержащих возбудителей; не является методом универсального мечения ДНК-зондов |
| ddPCR | Разделение реакционной смеси на множество микрокапель и абсолютный подсчёт положительных реакционных объёмов | Высокоточное количественное определение копий нуклеиновой кислоты, в том числе редких вариантов; получение меченого зонда не является основной задачей |
| RFLP и PCR-RFLP | Анализ различий в длине рестрикционных фрагментов после расщепления ДНК эндонуклеазами, иногда после предварительной ПЦР | Генотипирование полиморфизмов и выявление изменений сайтов рестрикции; метод не предназначен для синтеза меченого ДНК-зонда |
Важным критерием выбора DOP-PCR является необходимость получить достаточное количество материала из ограниченного или сложного геномного образца. Метод особенно полезен, когда исходная ДНК доступна в малом количестве, но требуется её расширенное представительство в составе зонда. Следует учитывать, что из-за вырожденности праймеров амплификация может быть неравномерной, поэтому при интерпретации результатов оценивают полноту геномного представительства и специфичность гибридизации.