2) амплификации
3) элюции
4) детекции
Внутренний контрольный образец вводят в исследуемый материал до начала выделения ДНК, чтобы он прошёл вместе с клиническим образцом все стадии пробоподготовки: лизис клеток, связывание нуклеиновых кислот с сорбентом, промывку и элюцию. Его последующее обнаружение подтверждает, что экстракция выполнена корректно, значимой потери нуклеиновых кислот не произошло, а в полученном элюате отсутствует критическое количество ингибиторов полимеразной цепной реакции.
Добавление контроля только в амплификационную смесь позволяет оценить работу реагентов и наличие ингибирования ПЦР, но не выявляет ошибки, возникшие при выделении ДНК. Введение контрольного материала на стадии элюции также не контролирует предшествующие этапы лизиса, сорбции и промывки. Поэтому отсутствие сигнала внутреннего контроля при отрицательном результате исследуемой мишени указывает на недостоверность анализа и необходимость повторного исследования, а не на подтверждённое отсутствие искомой последовательности.
| Вид контроля | Этап введения | Что оценивает | Интерпретация отклонения |
|---|---|---|---|
| Экзогенный внутренний контроль выделения | До лизиса или в лизирующий раствор | Экстракцию, сохранность нуклеиновой кислоты и амплификацию | Отсутствие сигнала свидетельствует о потере материала, ингибировании или технической ошибке |
| Эндогенный внутренний контроль | Изначально присутствует в биоматериале | Качество взятия образца и наличие клеточного материала | Отсутствие сигнала может указывать на неадекватное взятие или деградацию образца |
| Контроль амплификации | Непосредственно в реакционную смесь | Работоспособность ПЦР и наличие ингибиторов | Не позволяет оценить эффективность выделения ДНК |
| Положительный контроль | В отдельную реакционную пробирку | Активность реагентов и способность системы обнаруживать мишень | Отсутствие сигнала делает постановку анализа недействительной |
| Отрицательный контроль выделения | В начале пробоподготовки вместо клинического материала | Контаминацию на этапах экстракции и постановки ПЦР | Появление сигнала указывает на загрязнение и требует повторной постановки |
| Отрицательный контроль амплификации | При приготовлении ПЦР-смеси без матричной ДНК | Контаминацию реагентов или рабочей зоны ампликонами | Положительный сигнал свидетельствует о ложноположительном риске |
Сигнал внутреннего контроля должен соответствовать критериям, установленным инструкцией к тест-системе, включая допустимый диапазон порогового цикла Ct. Незначительное смещение Ct может отражать снижение эффективности выделения или частичное ингибирование реакции. При выраженном отклонении либо отсутствии сигнала результат по исследуемой мишени оценивают с учётом валидированных правил конкретного набора. Полноценная система контроля качества должна одновременно выявлять ошибки пробоподготовки, амплификации и возможную контаминацию.