2) определять субпопуляционный состав лимфоцитов (+)
3) выделять нуклеиновые кислоты
4) разделять белки по молекулярной массе
Проточная лазерная цитометрия основана на анализе клеток, проходящих по одной через лазерный луч в жидкостном потоке. При этом регистрируются светорассеяние и флуоресценция: прямое светорассеяние приблизительно отражает размер клетки, боковое — её внутреннюю сложность и гранулярность. Для иммунного фенотипирования применяют моноклональные антитела, меченные флуорохромами; связывание антител с определёнными антигенами CD позволяет установить принадлежность клетки к конкретной лимфоцитарной популяции.
Сочетание гейтирования по CD45 и параметрам светорассеяния с оценкой экспрессии CD-маркеров позволяет количественно определить Т-лимфоциты (CD3+), В-лимфоциты (CD19+ или CD20+) и NK-клетки (CD3−CD16/56+), а также субпопуляции Т-клеток, например CD4+ и CD8+. Поэтому метод используется для иммунологического мониторинга, диагностики иммунодефицитов, лимфопролиферативных заболеваний и оценки клеточного иммунитета. Выделение нуклеиновых кислот и разделение белков по молекулярной массе относятся к другим лабораторным методикам; определение группы крови выполняют серологическими или иммуногематологическими реакциями.
| Исследуемый признак | Основной сигнал или маркер | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Размер клетки | Прямое светорассеяние, FSC | Помогает отличать лимфоциты от моноцитов, гранулоцитов и клеточного дебриса. |
| Внутренняя структура клетки | Боковое светорассеяние, SSC | Отражает гранулярность и сложность цитоплазмы; используется совместно с FSC при построении гейта. |
| Т-лимфоциты | Экспрессия CD3 | Позволяет определить общую популяцию зрелых Т-клеток. |
| Т-хелперы и цитотоксические Т-клетки | CD3+CD4+ и CD3+CD8+ | Даёт возможность рассчитать абсолютное и относительное содержание функционально значимых субпопуляций. |
| В-лимфоциты | CD19+ или CD20+ | Используется для оценки В-клеточного звена иммунитета и выявления клональных В-клеточных популяций. |
| NK-клетки | CD3−CD16/56+ | Позволяет идентифицировать естественные киллеры, участвующие в противовирусной и противоопухолевой защите. |
| Жизнеспособность и апоптоз | Специальные флуоресцентные красители, Annexin V, маркеры проницаемости мембраны | Дополняет иммунный фенотип оценкой состояния клеток и доли живых, апоптотических или погибших элементов. |
Результат исследования выражают как процент клеток определённого фенотипа и, при использовании стандартизированных методик, как их абсолютное количество в единице объёма крови. Многопараметрическая регистрация нескольких флуорохромов в одной пробе повышает информативность анализа. При интерпретации учитывают компенсацию спектрального перекрывания флуорохромов, правильность выбора гейтов и наличие контрольных образцов.