2) проточная цитофлуориметрия (+)
3) иммуноблоттинг
4) полимеразная цепная реакция
Проточная цитофлуориметрия — метод анализа клеток и других частиц, находящихся во взвеси, в режиме последовательной регистрации отдельных событий. Гидродинамическая фокусировка направляет частицы по одной через лазерный луч. При пересечении зоны облучения регистрируются рассеяние света и флуоресцентное излучение, возникающее вследствие свечения естественных компонентов частицы или присоединённых флуорохромов.
Интенсивность прямого светорассеяния (FSC) обычно коррелирует с размером частицы, а бокового светорассеяния (SSC) — с её внутренней структурой, гранулярностью и сложностью. Флуоресцентные сигналы позволяют выявлять антигены, нуклеиновые кислоты, показатели жизнеспособности, апоптоза и клеточного цикла. Поэтому метод особенно важен для иммунофенотипирования клеток крови, диагностики гемобластозов, оценки иммунного статуса и количественного определения редких клеточных популяций.
| Метод | Исследуемый материал | Основной принцип регистрации | Типичный результат |
|---|---|---|---|
| Проточная цитофлуориметрия | Клетки или частицы в суспензии | Поштучная регистрация светорассеяния и флуоресценции при прохождении через лазерный луч | Иммунофенотип, размер и гранулярность клеток, доля отдельных популяций |
| Вестерн-блоттинг | Белковые экстракты | Электрофоретическое разделение белков, перенос на мембрану и выявление антителами | Полосы белков определённой молекулярной массы и их относительная экспрессия |
| Иммуноблоттинг | Белковые фракции после разделения | Иммунологическое выявление конкретного белка на твёрдой фазе | Наличие или интенсивность сигнала соответствующего антигена |
| Полимеразная цепная реакция | ДНК или РНК после выделения и подготовки образца | Ферментативная амплификация целевой нуклеотидной последовательности | Обнаружение или количественная оценка генетического материала |
| Прямое светорассеяние | Отдельная частица в потоке | Измерение рассеяния света преимущественно в направлении распространения лазерного луча | Оценка относительного размера частицы |
| Боковое светорассеяние и флуоресценция | Отдельная клетка с флуоресцентными метками | Регистрация внутренней гранулярности и свечения связанных флуорохромов | Разделение клеточных субпопуляций и определение экспрессии маркеров |
Ключевой диагностический принцип метода — сочетание многопараметрического анализа и поштучного учёта частиц. Результаты представляют в виде гистограмм, точечных диаграмм и рассчитанных процентных или абсолютных показателей клеточных популяций. Для повышения специфичности применяют моноклональные антитела, конъюгированные с различными флуорохромами, а также соответствующие изотипические и компенсационные контроли. В отличие от методов иммуноблоттинга и амплификации нуклеиновых кислот, проточная цитофлуориметрия непосредственно характеризует фенотип и физические свойства отдельных частиц в суспензии.