2) конформационных изменениях белковой молекулы
3) денатурации белка (+)
4) увеличении концентрации субстрата
Необратимая утрата ферментативной активности возникает при денатурации белка, поскольку разрушается его нативная пространственная организация. Нарушение вторичной, третичной и, при наличии, четвертичной структуры изменяет конфигурацию активного центра, поэтому фермент теряет способность специфически связывать субстрат и катализировать реакцию. Денатурация может сопровождаться агрегацией белковых молекул, разрушением дисульфидных связей или другими структурными изменениями, препятствующими восстановлению исходной конформации.
Охлаждение обычно лишь снижает скорость ферментативной реакции вследствие уменьшения кинетической энергии молекул; после возвращения к оптимальной температуре активность, как правило, восстанавливается. Конформационные изменения также не всегда означают денатурацию: физиологические переходы между конформациями могут быть обратимыми и участвовать в аллостерической регуляции. Увеличение концентрации субстрата повышает скорость реакции до достижения максимальной скорости, соответствующей насыщению активных центров, но само по себе не разрушает фермент.
| Воздействие | Основной механизм | Изменение активности | Обратимость |
|---|---|---|---|
| Охлаждение | Снижение кинетической энергии и частоты эффективных столкновений фермента с субстратом | Временное уменьшение скорости реакции | Обычно обратимо |
| Физиологическое конформационное изменение | Переход фермента между функциональными пространственными состояниями | Может активировать или ингибировать фермент | Как правило, обратимо |
| Денатурация белка | Разрушение нативной пространственной структуры и конфигурации активного центра | Выраженная или полная потеря каталитической активности | Часто необратимо, особенно при агрегации |
| Увеличение концентрации субстрата | Повышение вероятности образования комплекса фермент—субстрат до насыщения активных центров | Увеличение скорости до уровня Vmax | Не вызывает повреждения фермента |
| Крайние значения pH | Изменение ионизации аминокислот активного центра и нарушение белковых взаимодействий | Снижение или потеря активности | При умеренном воздействии может быть обратимо; при выраженном — необратимо |
| Тяжёлые металлы и другие химические денатурирующие агенты | Связывание с функциональными группами белка, включая сульфгидрильные группы, и нарушение структуры | Ингибирование или стойкая инактивация | Часто необратимо |
Таким образом, критерием необратимой инактивации является стойкое разрушение нативной структуры фермента и невозможность восстановления активного центра. Денатурацию вызывают, в частности, высокая температура, экстремальный pH, органические растворители и соли тяжёлых металлов. В лабораторной практике температурный режим и условия хранения подбирают так, чтобы предотвращать денатурацию и сохранять аналитическую активность ферментов.