2) хроматографический
3) ферментативный (+)
4) диазотирующий
Ферментативное определение билирубина считается референтным благодаря высокой аналитической специфичности реакции. В основе метода лежит окисление билирубина ферментом билирубиноксидазой с образованием биливердина. Изменение оптической плотности реакционной смеси, обусловленное уменьшением концентрации билирубина, регистрируют фотометрически; выраженность сигнала пропорциональна его содержанию в образце.
Важное преимущество метода — минимальное влияние неспецифических веществ сыворотки по сравнению с реакциями, основанными на образовании окрашенных производных. Для измерения общего билирубина используют условия, обеспечивающие солюбилизацию и доступ к ферменту как конъюгированной, так и неконъюгированной фракции; концентрацию прямого билирубина можно оценивать в более мягких условиях реакции. Благодаря высокой специфичности, воспроизводимости и возможности стандартизации ферментативный метод применяют как основу для сравнения результатов рутинных методик.
Диазотирующая реакция, несмотря на широкое использование в клинических лабораториях, зависит от состава реакционной среды, времени инкубации, гемолиза, липемии и присутствия лекарственных веществ. При ней билирубин превращается в окрашенный азобилирубин после взаимодействия с диазореактивом, поэтому результат может включать неспецифические спектральные влияния. Хроматографические методы полезны для разделения и идентификации отдельных форм билирубина, но сложнее, дороже и обычно не используются для массового рутинного анализа.
| Критерий | Ферментативный метод | Диазотирующий метод | Хроматографический подход |
|---|---|---|---|
| Основной принцип | Окисление билирубина билирубиноксидазой до биливердина с фотометрической регистрацией реакции | Образование окрашенного азобилирубина при взаимодействии с диазореактивом | Разделение пигментов по физико-химическим свойствам с последующей детекцией |
| Аналитическая специфичность | Высокая, поскольку используется специфическое ферментативное превращение субстрата | Ниже; возможны неспецифические реакции и влияние матрицы образца | Высокая при правильном разделении и идентификации фракций |
| Определяемый показатель | Общий или прямой билирубин — в зависимости от состава реакционной системы | Прямой билирубин определяется без ускорителя, общий — с ускорителем; непрямой часто рассчитывают | Позволяет раздельно оценивать билирубин, биливердин и отдельные конъюгированные формы |
| Основные интерференции | Существенно ограничены при соблюдении условий реакции; важны гемолиз и липемия как факторы фотометрической ошибки | Возможны искажения из-за гемолиза, липемии, лекарственных веществ, pH и избытка реагентов | Зависят от подготовки образца, полноты экстракции и качества хроматографического разделения |
| Роль в лабораторной диагностике | Референтная основа для точного количественного определения билирубина | Широко распространённая рутинная методика | Преимущественно специализированный и исследовательский анализ |
| Практическое ограничение | Требует стабильности фермента, стандартизованных условий и корректной калибровки | Результат сильнее зависит от состава реакционной смеси и времени измерения | Высокая стоимость, длительность анализа и необходимость специального оборудования |
Количественная оценка билирубина необходима для диагностики и мониторинга желтух, гемолиза, холестаза и нарушений функции печени. Интерпретация должна включать сопоставление общего и прямого билирубина с активностью аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы и гамма-глутамилтрансферазы. У новорождённых особенно важно учитывать возрастные нормативы и риск билирубиновой энцефалопатии. Результат также оценивают с учётом условий взятия, хранения и защиты образца от интенсивного света.