2) спирте 96% (+)
3) воде
4) глицерине
Для прямой реакции иммунофлюоресценции мазок-отпечаток необходимо быстро зафиксировать 96% этиловым спиртом. Спирт действует как коагулирующий фиксатор: обезвоживает материал, осаждает клеточные белки, закрепляет эпителиальные клетки на стекле и препятствует смыванию вирусного антигена. При этом сохраняется доступность антигенных детерминант для меченых флуорохромом специфических антител, после связывания которых вируссодержащие клетки выявляются по характерному свечению в люминесцентном микроскопе.
Фиксация также снижает риск распространения инфекционного материала и стабилизирует морфологическую структуру клеток. Формалин для этой цели менее предпочтителен, поскольку образует поперечные сшивки между белками и может маскировать антигенные участки, снижая интенсивность специфического свечения; кроме того, возможна более выраженная неспецифическая аутофлуоресценция. Вода не фиксирует мазок и вызывает осмотическое повреждение клеток, а глицерин используется преимущественно в составе заключающей среды для сохранения флуоресценции, но не для первичной фиксации.
| Среда или способ обработки | Основное действие | Пригодность для метода флюоресцирующих антител |
|---|---|---|
| 96% этиловый спирт | Коагуляция белков, обезвоживание, фиксация клеток и антигенов | Подходит для фиксации мазков-отпечатков перед иммуннофлюоресцентным окрашиванием |
| Холодный ацетон | Быстро фиксирует и обезжиривает клеточный материал | Может применяться в отдельных лабораторных протоколах как альтернативный фиксатор |
| Формалин | Сшивание белковых молекул и стабилизация тканевой структуры | Может маскировать антигенные детерминанты и снижать чувствительность реакции |
| Вода | Не вызывает полноценной фиксации; возможны набухание и лизис клеток | Непригодна для подготовки мазка |
| Глицерин | Снижает выцветание флуорохрома и используется как компонент заключающей среды | Не заменяет фиксатор и применяется после окрашивания |
| Прямая иммунофлюоресценция | Меченые антитела непосредственно связываются с вирусным антигеном | Результат оценивают по специфическому свечению антигенсодержащих клеток |
Качество фиксации является одним из ключевых преаналитических факторов достоверности исследования. Мазок следует фиксировать сразу после приготовления, не допуская высыхания и длительного хранения без обработки. Отрицательный результат при нарушении фиксации не исключает вирусную инфекцию, поскольку потеря или маскирование антигена может привести к снижению чувствительности метода. Интерпретацию проводят с учетом положительного и отрицательного контрольных препаратов.