2) 1, 2, 3, 4, 5 (+)
3) 4, 2, 3, 1, 5
4) 1, 3, 2, 4, 5
Правильная последовательность — 1 → 2 → 3 → 4 → 5. Она соответствует общему принципу последовательного проявления ТСХ-хроматограммы: сначала используют метод, практически не изменяющий исследуемые вещества, а затем переходят к химическим проявителям с возрастающим воздействием на хроматографические зоны. Поэтому первой выполняют визуализацию в УФ-свете: вещества, поглощающие ультрафиолетовое излучение или изменяющие флуоресценцию индикатора сорбента, выявляются без химической модификации и могут быть охарактеризованы по положению зоны и значению Rf.
На следующем этапе применяют систему ртути(II) сульфат — дифенилкарбазон с последующим нагреванием, обеспечивающую образование окрашенных комплексов с рядом соединений, способных взаимодействовать с ионами ртути; классический пример — производные барбитуровой кислоты и структурно близкие вещества. Затем используют смесь 57% хлорной кислоты и 0,5% раствора натрия нитрита, обладающую выраженными кислотно-окислительными свойствами. Она особенно информативна для производных фенотиазина и тиоксантена, у которых в результате окислительных превращений формируются характерно окрашенные продукты.
Реактив Драгендорфа наносят позднее как общеалкалоидный проявитель: протонированные азотистые основания образуют окрашенные ионные ассоциаты с комплексными иодвисмутат-анионами. Завершающей является реакция Браттона—Маршала, основанная на диазотировании первичной ароматической аминогруппы с последующим образованием окрашенного азосоединения; она используется, в частности, при выявлении соединений, непосредственно содержащих такую группу или образующих ароматические амины после химического превращения. Размещение этих реакций в конце схемы уменьшает риск того, что интенсивная химическая обработка помешает оценке результатов более ранних способов детекции.
| Этап | Способ детекции | Аналитический принцип | Практическое значение |
|---|---|---|---|
| 1 | УФ-свет | Поглощение УФ-излучения или изменение флуоресценции слоя | Неразрушающее первичное выявление хроматографических зон |
| 2 | HgSO4 + дифенилкарбазон, нагревание | Комплексообразование с ионами ртути и возникновение окрашенных продуктов | Дополнительная групповая дифференциация ряда лекарственных веществ |
| 3 | Хлорная кислота + натрия нитрит | Кислотно-окислительное превращение молекул | Характерные цветные реакции, особенно у фенотиазинов и тиоксантенов |
| 4 | Реактив Драгендорфа | Образование окрашенных ионных ассоциатов с протонированными азотистыми основаниями | Широкое групповое обнаружение алкалоидов и других органических оснований |
| 5 | Реакция Браттона—Маршала | Диазотирование ароматической аминогруппы с последующим азосочетанием | Дополнительная дифференциация веществ с первичной ароматической аминогруппой или ее предшественниками |
| Интерпретация | Совокупность реакций | Сопоставление Rf, УФ-характеристик и окраски зон | Формирование предварительного заключения о групповой принадлежности вещества |
Ненаправленный ТСХ-скрининг является ориентирующим, а не окончательно идентифицирующим исследованием. Совпадение значения Rf и цветовой реакции с веществом-свидетелем повышает диагностическую значимость результата, однако неспецифические групповые реагенты могут взаимодействовать с несколькими химическими классами. Поэтому обнаруженную зону необходимо подтверждать более селективными методами, прежде всего хромато-масс-спектрометрией или ВЭЖХ с подходящим детектированием. Следует также учитывать, что в некоторых методических схемах для веществ основного и слабоосновного характера после УФ-детекции вместо системы ртути(II) сульфат — дифенилкарбазон применяется 10% раствор железа(III) хлорида; при подготовке к конкретной аккредитации ориентируются на алгоритм, закрепленный в используемом банке заданий.