2) персульфата аммония
3) формамида (+)
4) тетраметилэтилендиамина (TEMED)
Формамид является химическим денатурантом, который нарушает водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. В результате снижается температура плавления двуцепочечных участков ДНК или вторичных структур одноцепочечных молекул, поэтому при электрофорезе они преимущественно находятся в развернутом состоянии. Это препятствует образованию шпилек и других конформаций, способных изменять электрофоретическую подвижность.
В денатурирующем полиакриламидном геле разделение нуклеиновых кислот становится более зависимым от длины фрагмента, а не от его пространственной конфигурации. Такой подход особенно важен при анализе продуктов секвенирования, мутаций, полиморфизмов и близких по размеру фрагментов ДНК, в том числе в судебно-медицинской молекулярно-генетической практике. Поэтому именно формамид соответствует условию создания денатурирующей среды.
Глицерин повышает плотность образца и облегчает его внесение в лунку, но сам по себе не денатурирует нуклеиновые кислоты. Персульфат аммония инициирует радикальную полимеризацию акриламида, а TEMED ускоряет разложение персульфата и образование полиакриламидной матрицы; оба вещества относятся к компонентам полимеризации геля, а не к денатурирующим агентам.
| Компонент или условие | Основное действие | Роль при электрофорезе |
|---|---|---|
| Формамид | Ослабляет водородные связи и стабилизирует одноцепочечное состояние нуклеиновых кислот | Создает денатурирующие условия; повышает зависимость подвижности от длины фрагмента |
| Мочевина | Нарушает водородные связи и вторичную структуру молекул | Альтернативный денатурант, часто используется в денатурирующем ПААГ |
| Глицерин | Увеличивает плотность и вязкость образца | Обеспечивает погружение образца в лунку; не является основным денатурантом |
| Персульфат аммония | Образует свободные радикалы | Инициирует полимеризацию акриламида и формирование геля |
| TEMED | Ускоряет образование свободных радикалов из персульфата | Катализирует полимеризацию полиакриламидной матрицы |
| SDS | Разрушает нековалентные взаимодействия в белках и придает им отрицательный заряд | Типичный денатурант для белкового SDS-PAGE, но не эквивалент формамиду при анализе ДНК |
Денатурирующий электрофорез позволяет устранить влияние вторичной структуры на разделение молекул. Для ДНК это повышает разрешающую способность метода и дает возможность выявлять минимальные различия в длине или последовательности фрагментов. В судебно-экспертной практике корректный выбор денатурирующего агента имеет значение для достоверной интерпретации генетического профиля. Формамид следует отличать от веществ, обеспечивающих загрузку образца или полимеризацию геля.