2) 105
3) 72
4) 95 (+)
Термостабильная ДНК-полимераза Taq выделена из бактерии Thermus aquaticus, обитающей в условиях высокой температуры. Фермент сохраняет функциональную пространственную структуру после кратковременного нагревания примерно до 95 °C, поэтому может участвовать в каждом последующем цикле полимеразной цепной реакции без повторного добавления. При этой температуре происходит денатурация двуцепочечной ДНК, а не эффективное удлинение праймеров.
Температура около 72 °C является оптимальной для каталитической активности Taq-полимеразы и синтеза новой цепи ДНК. Значение 50 °C соответствует нижнему диапазону температур отжига праймеров и не характеризует термостабильность фермента, тогда как 105 °C обычно приводит к быстрой утрате активности белка. Поэтому правильным является значение 95 °C: именно при кратковременных циклических воздействиях этой температуры Taq-полимераза сохраняет биологическую активность.
| Температура | Этап ПЦР или характеристика | Основной процесс | Состояние Taq-полимеразы |
|---|---|---|---|
| 50 °C | Низкий диапазон отжига праймеров | Гибридизация праймеров с матрицей; возможна неспецифическая амплификация при недостаточной строгости условий | Фермент активен, но температура обычно ниже оптимальной для элонгации |
| 55–65 °C | Отжиг праймеров | Формирование стабильных дуплексов праймер–матрица; температура зависит от состава и длины праймера | Сохраняет стабильность, но синтез цепи выражен ограниченно |
| 72 °C | Элонгация | Последовательное присоединение дезоксирибонуклеотидов к 3′-концу праймера | Близка к оптимальной температуре каталитической активности Taq-полимеразы |
| 94–95 °C | Денатурация в каждом цикле | Разрыв водородных связей и разделение двух цепей ДНК-матрицы | Фермент сохраняет активность после кратковременного воздействия; это ключевое свойство Taq |
| 95 °C | Проверка термостабильности | Повторное использование фермента в циклическом режиме амплификации | Правильный ответ: активность сохраняется, хотя скорость полимеризации при этой температуре не максимальна |
| Около 105 °C | Чрезмерное нагревание | Нарушение структуры белка вследствие интенсивной тепловой денатурации | Быстрая и выраженная инактивация фермента; для стандартной ПЦР температура не используется |
Термостабильность Taq-полимеразы обеспечивает автоматизацию многократных циклов ПЦР и лежит в основе ее широкого применения в молекулярно-генетической диагностике. Важно различать температуру сохранения активности и оптимальную температуру реакции: 95 °C необходима преимущественно для разделения цепей ДНК, а 72 °C — для их синтеза. При длительном или чрезмерном нагревании даже термостабильный фермент постепенно инактивируется. Дополнительным ограничением Taq-полимеразы является отсутствие выраженной 3′→5′-экзонуклеазной корректирующей активности, поэтому при высокоточной амплификации применяют ферменты с proofreading-функцией.