2) ДНК-полимеразу
3) дезоксинуклеотиды
4) ионы магния
В стандартной полимеразной цепной реакции ДНК-лигаза не требуется, поэтому именно она является правильным ответом. Основной этап амплификации — синтез комплементарной цепи ДНК на матрице, который выполняет термостабильная ДНК-полимераза после отжига праймеров. ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между уже сформированными фрагментами ДНК, но не осуществляет последовательное присоединение нуклеотидов при удлинении праймера.
Дезоксинуклеотидтрифосфаты служат субстратами для синтеза новых цепей, а ионы магния выполняют роль кофактора ДНК-полимеразы: они участвуют в связывании субстратов и катализе фосфодиэфирной связи. В состав типичной реакционной смеси также входят матричная ДНК, специфические праймеры и буфер, поддерживающий оптимальные pH и ионную силу. Использование ДНК-лигазы возможно в специальных методах, например в лигазной цепной реакции, но это не является обязательным компонентом классической ПЦР.
| Компонент или фактор | Основная функция | Роль в стандартной ПЦР |
|---|---|---|
| Матричная ДНК | Содержит участок, подлежащий амплификации | Источник копируемой последовательности |
| Праймеры | Определяют границы амплифицируемого фрагмента и предоставляют свободный 3′-конец | Необходимы для начала синтеза цепи |
| Термостабильная ДНК-полимераза | Присоединяет нуклеотиды к растущей цепи ДНК | Катализирует элонгацию в каждом цикле |
| Дезоксинуклеотидтрифосфаты | Являются субстратами для построения дочерних цепей | Обеспечивают материал для синтеза ампликона |
| Ионы магния | Кофактор полимеразы и участник взаимодействия фермента с дНТФ | Влияют на эффективность и специфичность реакции |
| Буферный раствор | Поддерживает оптимальные pH и солевые условия | Обеспечивает активность фермента и стабильность матрицы |
| ДНК-лигаза | Соединяет фрагменты ДНК фосфодиэфирными связями | Не входит в обязательный состав классической ПЦР; применяется в специальных лигазных методах |
Амплификация в ПЦР основана на повторяющихся циклах денатурации, отжига праймеров и элонгации. Результатом является экспоненциальное накопление фрагмента, расположенного между праймерами. Концентрация магния, дНТФ и праймеров должна быть сбалансирована, поскольку её изменение может снижать выход продукта или повышать неспецифическое образование ампликонов. Следовательно, отсутствие ДНК-лигазы не препятствует проведению стандартной ПЦР.