2) чем больше Ct (пороговый цикл) для образца, тем ниже эффективная матричная активность ДНК (+)
3) Ct (пороговый цикл) не является индикатором матричной активности ДНК в препарате
4) чем меньше Ct (пороговый цикл) для образца, тем ниже эффективная матричная активность ДНК
Правильным является положение о том, что при одинаковой эффективности амплификации увеличение Ct соответствует снижению эффективной матричной активности ДНК. Ct (cycle threshold) — это номер цикла, на котором флуоресцентный сигнал продукта амплификации пересекает заданный порог достоверного обнаружения. Если исходно в пробе содержится меньше амплифицируемых копий целевой последовательности, для достижения этого порога требуется больше циклов.
При равной эффективности реакции разница примерно в один цикл обычно соответствует приблизительно двукратному различию исходного количества матрицы при эффективности, близкой к 100 %. Поэтому низкое значение Ct указывает на большее количество доступной для амплификации ДНК и, соответственно, на более высокую эффективную матричную активность; высокое значение Ct — на меньшее количество целевого материала. В данном контексте оценивается не только физическое присутствие ДНК, но и возможность ее полноценного участия в реакции амплификации.
Интерпретация Ct должна учитывать качество выделения нуклеиновой кислоты, наличие ингибиторов, целостность ДНК, корректность постановки реакции и характеристики праймеров и зонда. При неодинаковой эффективности амплификации непосредственное сравнение Ct между образцами может быть некорректным, однако условие задачи исключает этот фактор. Отсутствие пересечения порога или крайне высокое Ct обычно свидетельствует о недостаточном количестве матрицы, ее деградации либо ингибировании реакции.
| Показатель | Низкое Ct | Высокое Ct |
|---|---|---|
| Исходное количество целевой ДНК | Больше амплифицируемых копий | Меньше амплифицируемых копий |
| Эффективная матричная активность | Выше: матрица быстро обеспечивает накопление ампликона | Ниже: для накопления продукта требуется больше циклов |
| Время достижения порога флуоресценции | Порог достигается раньше | Порог достигается позже |
| Разница в один цикл при эффективности около 100 % | Соответствует примерно двукратному различию количества исходной матрицы | |
| Возможные причины повышения Ct | Низкая концентрация ДНК, деградация матрицы, потери при выделении или присутствие ингибиторов | |
| Отсутствие достоверного Ct | Целевая последовательность не обнаружена либо ее количество ниже предела обнаружения; также возможна неработоспособность реакции | |
| Условие корректного сравнения образцов | Одинаковые праймеры, порог анализа, эффективность амплификации и сопоставимое качество проб | |
Таким образом, Ct является косвенным количественным показателем исходного содержания амплифицируемой ДНК. Чем раньше регистрируется пороговый сигнал, тем выше эффективная матричная активность образца. Повышение Ct при сопоставимой эффективности реакции указывает на уменьшение доступного для амплификации целевого материала. Окончательное заключение следует делать с учетом контрольных реакций и клинико-лабораторного контекста.