2) азотной кислоты раствора 1%
3) нитрата серебра раствора
4) карбоната натрия с формальдегидом раствора (+)
Карбонат натрия с формальдегидом используют на стадии проявления после импрегнации полиакриламидного геля нитратом серебра. Ионы серебра связываются преимущественно с азотистыми основаниями и фосфатными группами нуклеиновых кислот, однако сразу после обработки геля полосы остаются визуально неразличимыми. В щелочной среде, создаваемой карбонатом натрия, формальдегид восстанавливает связанные ионы Ag+ до металлического серебра Ag0.
Металлическое серебро осаждается в участках расположения фрагментов ДНК или РНК, формируя коричневые либо темно-серые полосы на относительно светлом фоне. Нитрат серебра выполняет функцию импрегнирующего красителя, но не является собственно проявителем. Этанол применяют преимущественно для фиксации нуклеиновых кислот в геле, а слабый раствор азотной кислоты может использоваться для окислительной обработки и снижения фонового окрашивания.
| Этап серебрения | Реагент или условие | Назначение | Диагностически значимый результат |
|---|---|---|---|
| Фиксация | Раствор этанола | Предотвращает диффузию разделенных фрагментов и удаляет мешающие компоненты | Полосы нуклеиновых кислот сохраняют положение в геле |
| Предварительная обработка | Разбавленная азотная кислота или другой окислитель | Повышает контрастность и уменьшает неспецифическое окрашивание | Снижается интенсивность фонового сигнала |
| Импрегнация | Раствор нитрата серебра | Обеспечивает связывание ионов Ag+ с нуклеиновыми кислотами | Создается основа для последующего выявления полос |
| Промывание | Деионизированная вода | Удаляет избыток несвязанного серебра | Предупреждается равномерное потемнение всего геля |
| Проявление | Карбонат натрия с формальдегидом | Создает щелочную среду и восстанавливает Ag+ до Ag0 | Появляются отчетливые темные полосы ДНК или РНК |
| Остановка реакции | Кислый стоп-раствор | Прекращает дальнейшее восстановление серебра | Сохраняются оптимальная контрастность и четкость электрофореграммы |
Серебрение отличается высокой аналитической чувствительностью и позволяет выявлять малые количества нуклеиновых кислот, что важно при исследовании ограниченного судебно-биологического материала. Продолжительность проявления необходимо строго контролировать, поскольку чрезмерная экспозиция вызывает потемнение фона и затрудняет интерпретацию полос. Равномерность промывания и качество реактивов непосредственно влияют на воспроизводимость результата. Следовательно, именно щелочной раствор карбоната натрия с формальдегидом обеспечивает непосредственное визуальное проявление электрофоретически разделенных фрагментов.