2) необходимость использовать положительный контроль амплификации
3) необходимость соблюдения требований к температурным условиям хранения исходного набора реагентов
4) контаминацию всего набора реагентов для ПЦР (+)
Разделение реакционных компонентов на рабочие аликвоты снижает риск контаминации всего исходного набора реагентов для ПЦР. При случайном попадании ампликонов, исследуемой ДНК или микроорганизмов загрязнённой оказывается преимущественно используемая аликвота, тогда как нераспечатанные порции сохраняют пригодность. Такой подход особенно важен для предотвращения ложноположительных результатов, поскольку ампликоны ранее проведённых реакций содержатся в высокой концентрации и легко распространяются с аэрозолями.
Аликвотирование является мерой профилактики перекрёстной контаминации, но не заменяет лабораторный контроль качества. Отрицательный контроль амплификации необходим для выявления загрязнения реагентов или рабочей зоны, а положительный — для подтверждения работоспособности реакционной смеси и корректности температурного режима амплификатора. Требования к хранению исходных реагентов также сохраняются: нарушение температуры, многократное замораживание и оттаивание могут привести к снижению активности полимеразы, деградации праймеров и зондов либо изменению характеристик буферной системы.
| Элемент лабораторной практики | Назначение | Что позволяет выявить или предотвратить |
|---|---|---|
| Аликвотирование реагентов | Разделение исходного набора на отдельные рабочие порции | Ограничивает загрязнение одной аликвотой и защищает основной запас реагентов |
| Отрицательный контроль амплификации | Проведение реакции без исследуемой нуклеиновой кислоты | Выявляет контаминацию реакционной смеси, расходных материалов или рабочей зоны |
| Положительный контроль амплификации | Использование образца с известной мишенью | Подтверждает активность реагентов и способность системы обнаруживать целевую последовательность |
| Внутренний контроль | Контроль выделения нуклеиновой кислоты и отсутствия ингибиторов | Помогает распознать ложноотрицательный результат из-за подавления ПЦР |
| Соблюдение температурного режима | Хранение компонентов в условиях, установленных производителем | Предотвращает деградацию ферментов, праймеров, зондов и контрольных образцов |
| Пространственное разделение зон | Раздельное выполнение подготовки реагентов, внесения образцов и анализа продуктов | Снижает перенос ампликонов в предамплификационные помещения |
Таким образом, аликвотирование не исключает саму возможность контаминации, а локализует её последствия. Рабочие порции следует готовить в чистой зоне, маркировать и использовать с отдельными наконечниками с аэрозольными фильтрами. Каждая постановка ПЦР должна сопровождаться предусмотренными контролями независимо от способа фасовки реагентов. Комплексное соблюдение этих мер обеспечивает достоверность результатов молекулярно-генетического исследования.