2) центрированности
3) зональности (+)
4) трансформации
Принцип зональности необходим для предотвращения контаминации образцов и реакционных смесей амплифицированной ДНК. В молекулярно-генетических исследованиях, особенно при использовании ПЦР, даже минимальное количество чужеродного ампликона может привести к ложноположительному результату и ошибочной идентификации лица. Поэтому помещения, оборудование, расходные материалы и потоки персонала организуют с разделением чистых и загрязнённых этапов.
Рабочий процесс строится в одном направлении: от приёма и подготовки объектов к выделению ДНК, затем к постановке реакции и далее к амплификации и анализу продуктов. Зоны для выделения нуклеиновых кислот и приготовления реакционных смесей изолируют от помещений, где открываются пробирки после ПЦР, поскольку именно постамплификационный материал обладает высокой концентрацией копий ДНК и представляет основной источник аэрозольной контаминации.
Зональность включает также раздельные комплекты халатов, перчаток, пипеток и других принадлежностей, использование фильтрующих наконечников, регулярную дезинфекцию поверхностей, ультрафиолетовую обработку по установленному режиму и обязательный контроль качества. Достоверность результата подтверждается применением отрицательных контролей, контрольных образцов и оценки возможного загрязнения на каждом критическом этапе.
| Зона | Основные операции | Ключевые требования | Основной риск |
|---|---|---|---|
| Приём и первичная обработка | Регистрация объектов, оценка упаковки, отбор материала | Проверка целостности упаковки, идентификация образца, предотвращение смешения объектов | Перекрёстное перенесение биологического материала |
| Выделение ДНК | Лизис клеток, очистка и получение экстракта нуклеиновой кислоты | Отдельные инструменты и расходные материалы, контроль отрицательных проб | Попадание чужой ДНК в исследуемый экстракт |
| Приготовление реакционной смеси | Дозирование праймеров, дезоксинуклеотидов, буфера и фермента | Работа в чистой зоне, фильтрующие наконечники, минимизация образования аэрозолей | Контаминация компонентов до внесения ДНК |
| Внесение ДНК и постановка ПЦР | Добавление исследуемых экстрактов и контролей в реакционные пробирки | Однонаправленный поток, раздельная маркировка, соблюдение предотвращения перепутывания проб | Перенос ДНК между образцами |
| Амплификация и детекция | Проведение циклов ПЦР, анализ генетических маркеров, электрофоретическая или приборная регистрация | Оборудование не используют для чистых этапов; результаты сопоставляют с контролями | Ложноположительный профиль из-за ампликонов |
| Постамплификационная зона | Открытие пробирок с продуктами ПЦР, электрофорез, анализ и хранение ампликонов | Физическая изоляция от предамплификационных помещений, отдельная спецодежда и инвентарь | Массовое распространение ампликонов по лаборатории |
Соблюдение зональности является элементом системы обеспечения аналитической достоверности и доказательности судебно-генетического исследования. Нарушение разделения потоков требует документированной оценки влияния на результат и, при необходимости, повторного исследования из исходного материала. Особенно важны прослеживаемость перемещения образцов, регистрация процедур обеззараживания и регулярный мониторинг отрицательных контролей. Такой подход снижает риск ошибочного включения генетического профиля в сравнительное исследование.