2) термическая денатурация молекулы ДНК
3) осаждение ДНК (+)
4) отжиг праймеров
Осаждение ДНК не относится к этапам амплификационного цикла полимеразной цепной реакции. Это лабораторный способ выделения или очистки нуклеиновых кислот, основанный на снижении растворимости ДНК в присутствии спирта и солей. Его применяют до постановки ПЦР при подготовке биологического материала либо после реакции для очистки полученного продукта, однако оно не обеспечивает копирование исследуемой последовательности.
Каждый цикл классической ПЦР включает три последовательно повторяющиеся стадии: термическую денатурацию двухцепочечной ДНК, отжиг праймеров на комплементарных участках матрицы и элонгацию новых цепей термостабильной ДНК-полимеразой. При эффективной реакции количество целевого фрагмента теоретически удваивается в каждом цикле, что приводит к его экспоненциальному накоплению. В судебно-генетической экспертизе этот принцип позволяет исследовать малые количества ДНК из следов крови, слюны, эпителиальных клеток, волос и других объектов.
| Этап или процедура | Основной механизм | Типичное место в исследовании | Отношение к циклу ПЦР |
|---|---|---|---|
| Денатурация | Разрыв водородных связей и разделение двух цепей ДНК при нагревании | Начало каждого цикла | Обязательная стадия |
| Отжиг праймеров | Комплементарное связывание олигонуклеотидных праймеров с матричной ДНК | После снижения температуры | Обязательная стадия |
| Элонгация | Синтез новой цепи ДНК от 3′-конца праймера с участием ДНК-полимеразы | После отжига праймеров | Обязательная стадия |
| Начальная денатурация | Полное разделение исходных молекул ДНК и активация некоторых типов полимераз | До первого цикла | Этап программы, но не отдельная фаза каждого цикла |
| Финальная элонгация | Завершение синтеза неполностью достроенных цепей | После последнего цикла | Дополнительный этап программы |
| Осаждение ДНК | Выведение нуклеиновой кислоты из раствора спиртом в присутствии солей | При выделении или очистке ДНК | В цикл амплификации не входит |
Для судебного эксперта принципиально важно разграничивать амплификацию и пробоподготовку. Качество предварительного выделения ДНК влияет на чувствительность исследования, поскольку примеси могут ингибировать полимеразу и вызывать частичную утрату генетического профиля. Корректность результата также обеспечивают отрицательные и положительные контроли, соблюдение противоконтаминационного режима и раздельная организация зон подготовки проб и анализа продуктов ПЦР. Следовательно, осаждение служит вспомогательной процедурой работы с нуклеиновыми кислотами, а не стадией их циклического копирования.