2) обнаружения мутаций в геноме патогена
3) идентификации генома патогена
4) оценки биохимической активности патогена
Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на специфическом взаимодействии антигена с антителом и ферментной индикации образовавшегося иммунного комплекса. Один из компонентов реакции фиксируют на твёрдой фазе, затем последовательно добавляют исследуемый материал и конъюгат — антитело или антиген, связанный с ферментом. После внесения субстрата возникает окрашенная реакция, интенсивность которой регистрируют фотометрически и сопоставляют с калибровочными или контрольными значениями.
В зависимости от формата ИФА выявляет либо антиген возбудителя в клиническом образце, либо специфические антитела классов IgM, IgG и других изотипов в сыворотке крови. Обнаружение IgM может указывать на недавнюю или текущую инфекцию, тогда как диагностически значимое нарастание титра IgG в парных сыворотках или сероконверсия подтверждают формирование иммунного ответа. Метод не определяет непосредственно нуклеотидную последовательность и мутации генома: для этого применяют молекулярно-генетические методы, прежде всего ПЦР и секвенирование.
| Вариант метода | Что выявляют | Основной принцип | Типичный диагностический результат |
|---|---|---|---|
| Прямой ИФА | Антиген патогена | Меченое ферментом специфическое антитело связывается с антигеном в образце | Положительный сигнал свидетельствует о наличии антигенного материала возбудителя |
| Непрямой ИФА | Специфические антитела пациента | Антитела сыворотки связываются с фиксированным антигеном, затем выявляются ферментным антиглобулиновым конъюгатом | Определение IgM, IgG и оценка серологического ответа |
| Сэндвич -ИФА | Растворимый антиген | Антиген удерживается парой антител: иммобилизованным и меченым детектирующим | Высокая специфичность и возможность количественного определения антигена |
| Конкурентный ИФА | Антиген или антитело при конкуренции реагентов | Исследуемое вещество конкурирует с меченым аналогом за ограниченное число мест связывания | Интенсивность сигнала обычно обратно пропорциональна концентрации аналита |
| ПЦР | ДНК или РНК возбудителя | Амплификация специфического участка генома с последующей детекцией продукта | Подтверждение присутствия генетического материала, возможна генотипизация |
| Секвенирование | Нуклеотидная последовательность генома | Определение последовательности нуклеотидов и её сравнение с референсными вариантами | Выявление мутаций, генетических линий и вариантов патогена |
Интерпретация ИФА должна учитывать сроки заболевания, иммунный статус пациента, диагностическую чувствительность и специфичность тест-системы. Положительный серологический результат не всегда означает наличие активной инфекции, поскольку антитела могут сохраняться после выздоровления или вакцинации. При сомнительных результатах используют повторное исследование, определение авидности антител, исследование парных сывороток или подтверждение методом выявления генома.